雨生红球藻中虾青素生产性提取
2018-09-07 13:25:59
雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）是一种绿藻，普遍分布在淡水水域，有营养细胞和厚壁孢子2种细胞生长状态, 前者是绿色的，生长旺盛，此阶段产生极少或者不产生虾青素；后者只有在恶劣条件下, 在细胞膜外产生厚壁，并开始诱导合成积累类胡萝卜素，80%以上为虾青素。在雨生红球藻中，虾青素70%是单酯状态，25%是二酯状态，仅有5%的虾青素为游离状态。目前雨生红球藻的研究和应用受到了微藻界科研人员等的高度重视，随着人们对产品功效的不断认可，雨生红球藻的养殖和生产量还远远不能满足市场的需求。另外，将雨生红球藻进行规模化生产时，其培养和提取过程中都尚存在诸多问题亟待研究和解决。
虾青素是一种高效纯天然抗氧化剂。虾、蟹等水产品的废弃物，红发夫酵母及雨生红球藻是天然虾青素的主要生物来源。其中，水产品废弃物的体内虾青素含量很低，提取成本也较高；红发夫酵母中虾青素含量也很低，仅为0.4％；雨生红球藻中虾青素含量可高达1.5%-3%，被确认为自然界中生产天然虾青素的较佳生物来源。天然虾青素的抗氧化性很高，大约是类胡萝卜素抗氧化的10倍、约是维生素E抗氧化性的550倍。因此，虾青素在保健品、食品、医药、化妆品、生物制剂以及饲料、饵料添加剂等领域需求很大和应用前景也很广阔。虾青素是一种含氧衍生物, 属于类胡萝卜素，具有很强的抗氧化生物活性，也表现出诸多特殊的生理作用：着色能力、增强动物免疫力、抑制细胞癌变诱发肿瘤、清除体内氧自由基和活性氧、提高机体细胞抗衰老能力等。虾青素有化学合成和生物提取两类主要来源。研究指出，化学合成的虾青素在结构、功能、安全性和应用等各方面均没有天然提取的有优势, 美国食品药品监督管理局明令禁止化学合成的虾青素投入市场、进入食品行业。对动物和人体进行实验表明，天然虾青素没有任何毒副作用, 对人体和动物在安全性和可靠性方面均有保障。天然虾青素具有广阔的开发潜力, 可用于水产动物养殖的饲料添加剂和人类的食品添加剂,同时在医药、化妆品和功能性食品等诸多领域均具有极大的发展潜力。利用雨生红球藻来生产天然虾青素已成为国内和国外的研究热点，充分利用雨生红球藻中的活性成分——虾青素的生理功能进行研究和开发新产品，用于治疗和预防癌症等方面也取得了一定成效。
雨生红球藻在培养过程中会出现容易染菌、不易生长等问题，而且虾青素提取的过程也比较繁琐，包括细胞破壁的破粹，提取过程及后序的分离提纯等过程。常用的虾青素提取方法有：有机溶剂浸提法、植物油法和临界CO2萃取法等。不同提取方法都各有优缺点，其中植物油法提取虽然安全性较高, 但植物油自身的沸点较高, 后期分离工作较难，处理也较难而很少被工业采用；临界CO2萃取法由于产品易分离、提取过程易控制、安全无毒等优点为工厂所采取, 但成本较高。有机溶剂浸提法容易操作和控制，易分离，溶剂可重复利用等优点，因此，工业化生产主要采用有机溶剂浸提法, 提取费用低且提取效率较高。同时雨生红球藻破壁效果的好坏也会直接影响到虾青素提取量的多少，因此，破壁也是提取虾青素的关键环节。后序分离工作则会直接影响到产品的质量及纯度，本文主要是对探究高压均质法对雨生红球藻的破壁效果。
原料及仪器
分光光度计（UV—2000）、快速混匀器（SK—1）、移液枪（X40957）、恒温水浴锅（HH—S）、电子天平（FA1104）、冰箱（BCD-205TA）、台式离心机（TGL-16C）、声波（KQ-500DB）、高压均质机(NanoDeBEE45-4)。
本实验所用雨生红球藻鲜藻膏为鲁东大学大境藻类研究所提供。
试验方法
（1）分别量取8份1mL的新鲜雨生红球藻藻膏浓缩液置于1-8号烧杯中，分别加入100mL的丙酮、丙酮/乙醇2:1(v/v)、丙酮/乙醇1:2(v/v)、丙酮/乙醇 1:1(v/v)、氯仿、乙醇/氯仿2:1(v/v)、乙醇/氯仿 1:2(v/v)、乙醇/氯仿1:1(v/v)、乙醇9种有机溶剂分别放入均质机中。
（2）在140MPa的压强下的条件下均质，并循环3次。
（3）4000r/min离心5分钟，在波长在473nm波长下测其吸光光度值，并检测结果。重复实验，记录实验数据。
试验结果
这5种常用的破壁方法中，不论提取剂是丙酮/乙醇为2:1（v/v），还是氯仿/乙醇1:1（v/v），其结论是一致的，高压均质法提取效果较好，声波法的机械破壁法的效果较低，提取率从高到低依次为高压均质法>研磨法>玻璃珠法>酶法>声波法，声波与酶法、玻璃珠法无显著差异，而与研磨法和高压均质法均有显著性差异，研磨法与高压均质法也差异明显，高压均质法与声波法差异显著，与其他破壁方法差异极显著，因此，优化成效明显。对于在每一个小实验中乙醇为2:1（v/v）为提取剂时提取率要略高于氯仿/乙醇1:1（v/v）的提取率，F检验，无差异，没有统计学意义，但却能看出前者要略胜于后者，氯仿的提取率要优于丙酮的提取效率，是因为虾青素在氯仿的溶解度要比在丙酮中的溶解度高而导致的。
较适用于大规模生产的方法是高压均质法，研磨法虽然提取率比较高，但处理量较少，操作耗时耗人工，对虾青素有一定的破坏，后续操作较复杂，增加了生产成本，且不适于工业化生产。酶法破壁的操作非常繁琐，耗时，能耗高，大规模生产的成本较高，包括酶液的调制及酶处理后的分离和干燥，且提取周期长，会使增加虾青素的氧化分解，干燥过程的高温也会对虾青素造成破坏，因而提取率不高。玻璃珠法是较常见的方法，较多的用于实验室阶段，操作程序较简单，但提取较耗时，应用于工厂化生产有一定困难。声波法，提取温度不高，易控制和操作，但声的处理量不多，能耗，且提取率较低而不被采取。高压均质机是利用高压的条件下，并控制液体流速，将红球藻细胞璧破碎，缩短了工时，是集破壁与提取同时进行的一种工业技术，省去了很多不必要的工序，降低了生产及设备投资，提取条件易控制，缩短生产周期，提取进行的时间较短，使得对虾青素的破坏大大降低，保护了虾青素，也保证了各项生理活性，提高了生产效率，进一步降低生产成本，提高了提取效率，破璧达到90%以上，且处理量较大，因此，非常适用于工厂规模化生产。
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酶解结合物理法对雨生红球藻破壁处理的工艺研究_余绍蕾.pdf |
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