银耳芽孢及菌丝总蛋白提取办法建立
2018-09-07 13:32:28
银耳（Tremella fuciformis），又名白木耳、雪耳、银耳子等，是一种著名的药食两用真菌，富含多糖、蛋白质、维生素及无机盐，被誉为“菌中之冠”。我国是世界上较早进行银耳驯化和人工栽培的国家，同时也是目前世界上银耳的生产和消费大国。早期对银耳的研究主要集中在传统的生物学特性、栽培技术、病虫害防治及生活史等方面，后来人们对银耳的研究逐渐从传统领域扩展到了理化性质、多糖提取、免疫分析及遗传性质等方面。虽然已经取得了一系列的成果，但总的来说主要集中在应用方面，关于基础理论的研究还是相对较少，特别是关于银耳不同生长发育阶段的机理及调控机制等还亟待进一步的探究。
银耳中富含蛋白质、多糖及脂肪，还富含维生素D和硒等微量元素，其中蛋白质富含多种氨基酸，能提供人体所必需的大多数氨基酸；维生素D能防止人体中钙的流失，因此能提高骨强度，还可以防止蛀牙，对各年龄段的人群都十分有益；银耳酚酸具有抗氧化及抗炎作用等生理功能；但银耳众多营养成分中较受关注的当属银耳多糖，银耳多糖是早已是人们对银耳医疗保健功能研究的主要营养成分，因其特殊结构使之具有提高免疫、抗肿瘤、抗氧化、降血脂及抗衰老等生理功能，而且人们在医药方面和化妆品已经开发了很多产品，提高人体健康水平的同时也产生了巨大的经济效益。
银耳中总蛋白的有效提取是进行蛋白质生理功能研究的重要前提，对后续银耳不同生长发育阶段蛋白质差异表达的研究具有重要意义。不同食用菌材料中总蛋白的较适提取方法不同，其中样品的前处理主要有声波、液氮研磨及高压均质等方法，具体的提取方法主要有TCA/丙酮沉淀法、Tris-饱和酚法及Tris-饱和酚结合TCA/丙酮沉淀法等。本文的研究思路是先确定细胞破碎的前处理方法，在此基础上再确定总蛋白的提取方法。具体的研究过程是在液氮研磨的基础上分别采用声波与高压均质进行细胞破碎，比较Tris-饱和酚法、TCA/丙酮沉淀法及Tris-饱和酚结合TCA/丙酮沉淀法3种方法提取银耳芽孢总蛋白的效果，可以得出其中效果较佳的方法，再验证该方法对银耳菌丝总蛋白的提取效果，从而建立了一种较为有效的银耳芽孢及菌丝总蛋白提取方法。
原料及仪器
台式冷冻离心机（Beckman）；凝胶成像系统（Bio-Rad）；低温冰箱（Thermo Fisher Scientific）；E1ix/RiOs纯水净化系统（Millipore）；UV-1800紫外可见分光光度计（Shimadzu）；AL-204型分析天平（METTLER TOLEDO）； NanoDeBEE30-4高压均质机,苏州微流纳米生物技术有限公司；声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；HH-2型恒温数显水浴锅（国华电器有限公司）；SHP-250型生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司）； 卧式圆形压力蒸汽灭菌器（上海华线医用核子仪器有限公司）；DYY-8C型电泳仪（北京六一仪器厂）。
13号芽孢及32号芽孢；13×32号菌丝；培养基PDA和PDB；三氯乙酸、硫脲、脲、甲醇、乙酸铵、乙醇、乙酸、硝酸银、硫代硫酸钠、乙酸钠、丙酮，以上都为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；载体两性电解质、考马斯亮蓝R-250、考马斯亮蓝G-250、Tris-饱和酚（北京索莱宝科技有限公司）；三羟甲基氨基甲烷、EDTA二钠（AR）（Amresco）；蛋白酶抑制剂混合物（康为世纪生物科技有限公司）；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（谷歌生物公司）。
试验方法
Tris-饱和酚法是参考灵芝及双孢蘑菇子实体总蛋白提取时所用的方法具体操作如下：
（1）称取0.1g银耳芽孢或菌丝于研钵中，用液氮迅速研磨成粉末，取80mg左右至50mL离心管中。
（2）加5mL抽提液（0.1mol/L Tris-HCl pH8.8，0.01mol/L EDTA，0.01mol/L PMSF，0.05mol/L DTT）至离心管中，充分振荡混匀。
（3）经声波（功率：195W，时间：10min）或高压均质（压力：160MPa，时间：5min）破碎后，4 ℃12000r/min离心30min。
（4）保留上清，按1:1体积比加入Tris-饱和酚，室温混悬后4℃12000r/min离心30min。
（5）保留酚相，在酚相中加入0.1mol/L Tris-HCl（pH8.8）及0.01mol/L DTT后再加入4倍体积甲醇（含0.01 mol/L乙酸铵及0.01mol/L DTT），-80℃沉淀1h以上。
（6）4℃12000r/min离心30min，沉淀用预冷的90%乙醇（含0.01mol/L DTT）洗涤2-3次，4℃12000r/min离心20min。
（7）蛋白沉淀物室温干燥后，加入溶解液（8.5mol/L脲，2.5mol/L硫脲，5%CHAPS，1%载体两性电解质，0.1mol/L DTT）中，室温混悬1h。
（8）4℃12000r/min离心30min，上清即为蛋白质样本溶液，-4℃保存。
试验结果
将液氮研磨/高压均质确定为前处理方法及Tris-饱和酚法作为提取方法之后，便采用该方法提取银耳芽孢及菌丝中的总蛋白，提取后测定蛋白含量并进行SDS-PAGE分析。从蛋白含量测定结果和SDS-PAGE电泳结果可以看出，该方法能较为有效地提取出银耳13号芽孢、32号芽孢及13×32号菌丝中的总蛋白，就提取出的蛋白含量而言，芽孢高于菌丝，13号芽孢高于32号芽孢；就获得的蛋白种类而言，13号芽孢与32号芽孢之间差异不大，即不同型号的芽孢之间差异不大，但芽孢与菌丝之间差异明显，在低分子量区间芽孢中提取出的蛋白种类多于菌丝。
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