麦胚凝集素修饰延缓脂质体
2018-11-05 09:49:23
角膜是药物在眼部吸收的主要屏障,其亲脂性的上皮层通常对药物透过的阻力较大.脂质体由磷脂双分子层构成,易与上皮细胞膜融合,具有促进药物跨膜转运的功能.脂质体能够增加药物的角膜通透性,提高眼内生物利用度,同时具有延缓药物释放和降低药物毒性等优点,因而其眼部应用越来越引起药剂学者的关注.脂质体不足之处在于其眼部滞留能力尚需进一步改善,否则将影响脂质体促进药物吸收的效果.有研究报道,脂质体滴入结膜囊内后,其消除速率与药物水溶液并无差异.眼角膜、结膜和巩膜表面覆盖着厚度为3～40μm的黏液层,其主要成分为高度糖基化的黏蛋白.利用这一生理特征可设计黏膜黏附性的眼部给药系统.但是眼睛对异物有效的清除机制,使得代基于黏膜黏附性聚合物的液体剂型难以获得理想的定位释药效果.第二代生物黏附系统是当前的研究热点,其特征在于能够通过类似'配体−受体'间的相互作用直接与黏蛋白或细胞膜结合,产生黏附效果.例如,将生物黏附性的小分子或聚合物修饰至药物载体的表面,从而延长微粒给药系统在眼部的滞留时间.凝集素(lectin)是一类能够选择性地识别糖基化配体,并与之可逆结合的蛋白.眼黏膜不仅存在大量的糖基化配体(黏蛋白),而且眼表上皮细胞表面广泛分布着N-乙酰氨基葡萄糖,二者均为凝集素的特异性结合位点.因此,本文构建了麦胚凝集素(wheat germ agglutinin,WGA)修饰的脂质体,利用WGA与黏蛋白间的特异性结合将脂质体锚定于眼组织表面,期望实现结膜囊内定位释药,进一步促进药物在眼部吸收.
材料与方法
氢化大豆磷脂(上海艾伟特医药科技有限公司),甲氧基聚乙二醇−磷脂酰乙醇胺(德国Lipoid 公司),马来酰亚胺−聚乙二醇−磷脂酰乙醇胺(美国Nanocs公司),胆固醇(上海化学试剂公司),麦胚凝集素(英国Vector Laboratories 公司),5-羧基荧光素(山东淄博昀辉生物化工技术有限公司),2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐(美国Sigma公司),5,5'-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸)（比利时AcrosOrganics公司）,N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸（上海加虹科技有限公司）,层析柱填料Sephadex G-25,G-50,Sepharose CL-4B(瑞典Pharmacia公司),四硼酸钠(分析纯,中国医药集团上海化学试剂公司),其他试剂均为市售分析纯.
层析柱(上海锦华层析设备厂),Gextruder挤出器(美国Genizer公司),核孔膜(美国Whatman公司),粒度/zeta电位测定仪(MalvernNanoZS,英国),紫外分光光度计(UV-2401PC,日本Shimadzu公司),荧光分光光度计(F-1000,日本Hitachi公司),荧光显微镜(DMI4000 B,LEICA,德国),小动物活体成像系统(美国CRI公司).
包载FAM脂质体的制备,脂质体膜材料处方组成为HSPC/Chol/mPEG-DSPE(55:45∶5,mol/mol).称取上述膜材料溶于氯仿,减压旋转蒸发除去氯仿,得均匀脂质膜,真空干燥24h.以FAM水溶液(2mg-mL−1)水化脂质膜,60℃水浴振荡2h,得脂质体混悬液.然后用微型挤出器依次将脂质体挤压过400、200、100和50nm核孔膜.以生理盐水为洗脱液过Sephadex G-50层析柱,分离除去未包封的FAM,得包载FAM的脂质体 (LS/FAM).WGA修饰脂质体制备,按照上述方法制备包载FAM的Mal-脂质体 (Mal-LS/FAM),材料处方组成为HSPC/Chol/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE(55:45:2:3,mol/mol).未过柱纯化的Mal-LS/FAM混悬液中加入巯基化WGA溶液(巯基化WGA与Mal-PEG-DSPE的摩尔比为1.2:1),室温搅拌反应8h,分别以洗脱液B(10 mmol·L−1 HEPES,0.1mmol·L−1CaCO3,pH8.5)和生理盐水洗脱过Sepharose CL-4B层析柱,除去游离FAM和WGA,得到包载FAM的WGA-脂质体(WGA-LS/FAM).脂质体的表征取脂质体适量,加生理盐水分散并稀释,利用粒度/zeta电位测定仪测定脂质体粒径大小及分布情况.所得巯基化WGA每分子中含1.32个巯基.WGA-LS/FAM的平均粒径为(97.40±1.39)nm,多分散系数为0.23±0.01,FAM的包封率为(2.95±0.21)%,体外24h的渗漏率约为4%.红细胞凝集实验表明,修饰到脂质体表面的WGA仍保持其糖蛋白结合活性.
 |
麦胚凝集素修饰延缓脂质体眼部消除_张文见.pdf |
