凝胶过滤层析法调节脂质体内外水相pH的探讨
2018-11-05 09:44:18
阿霉素是一种蒽环类抗生素,主要用于急性白血病、恶性淋巴瘤和乳腺癌等多种肿瘤的临床治疗.但因其心脏毒性、骨髓抑制、消化道毒性、免疫抑制及致突变等毒副作用,使其应用受到很大限制.自从1965年Bangham发现脂质体后,1971年Gregoriadis等首次报道将脂质体作为药物载体.研究发现,脂质体可作为蒽环类抗肿瘤药物的有效载体,其代表产品是阿霉素脂质体,可显著降低阿霉素的毒副作用.脂质体常用的载药方法可分为被动载药法和主动载药法.被动载药法适于亲脂性强的或亲水性强的药物,首先将药物溶于水相或有机相中,然后按适当的方法(成膜水化法、高压均质法、逆向蒸发法和乙醇注入法等)制备得到含药脂质体.主动载药法适用于两亲性药物,首先制备空白脂质体,脂质体内外水相形成pH梯度或离子梯度,再将药物加入脂质体外水相,在pH 梯度或离子梯度的驱动下,两亲性药物自发地跨越脂质双分子层由脂质体的外水相渗透进入内水相.与被动载药法比较,主动载药法具有包封率高、载药量高,且稳定性好的特点.通常采用以下的方法在脂质体内外水相形成pH梯度:透析法、滤离心法、凝胶过滤层析法和碱调节法.前3种方法视脂质体外水相的柠檬酸为小分子物质,脂质体为大分子物质,可根据两者分子大小的差异达到分离的目的.透析法,利用小分子溶质在可通过半透膜,而大分子溶质不能通过半透膜的性质,达到分离得目的;滤法是一种加压膜分离技术,即在一定的压力下,使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径半透膜,大分子溶质不能透过,达到分离的目的.凝胶过滤层析法:又称分子排阻层析法,是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物质的分子大小不同达到分离的目的.碱调解法,直接在脂质体的外水相加入碱溶液进行pH调节.比较以上4种方法,透析法耗时,滤离心法的压力可能影响脂质体的稳定性,碱调节法中碱溶液的加入使得脂质体内外水相的渗透压不同,导致脂质体稳定性降低.与上述3 种方法比较,凝胶过滤层析法具有操作简便快速,对脂质体影响小.基于此,本文拟采用凝胶过滤层析法调节脂质体内外水相的pH梯度,主动载入阿霉素,考察不同阿霉素投料量的脂质体包封率,以及初步评价阿霉素脂质体的稳定性. 方法与结果
分别精密称取氢化大豆磷脂、胆固醇和聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺(摩尔比为1:1:0.04)溶于氯仿,减压旋转蒸发除去氯仿,得均匀脂质膜,真空干燥24h.加入一定体积的0.2mol/L pH4.0枸橼酸缓冲液,60℃水浴震荡2h,得脂质体混悬液.在60℃恒温器上,使用微型挤出器依次将脂质体挤压过400、200和100nm核孔膜,得空白脂质体.以0.2mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液为洗脱剂,将空白脂质体洗脱通过Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱(1×10cm)交换外水相,流速1mL/min,收集脂质体混悬液,其脂质终浓度为20mmol/L.分别按照药脂比1:5、1:10、1:15和1:20(质量比)在上述脂质体混悬液加入阿霉素溶液,60℃水浴20min,期间涡旋3次.以0.2mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液洗脱通过Sephadex G-50凝胶柱(1×10cm),流速1mL/min,去除游离药物,收集阿霉素脂质体,激光散射粒度仪测定粒径及其分布.精密称取阿霉素标准品适量,以酸性异丙醇溶液为溶剂配置成1～50mg/L 系列浓度的标准溶液,以酸性异丙醇为空白对照,分别测定阿霉素大至吸收波长处(480nm)的吸光度值,绘制标准曲线.精密量取阿霉素脂质体0.5mL,加入酸性异丙醇溶液2.0mL,涡旋1min,测定480nm处的吸光度值，根据标准曲线计算含量.按照以下公式计算包封率,EE=C/C.
凝胶过滤层析法调节脂质体内外水相pH梯度,按照药脂比1:5、1:10、1:15和1:20将阿霉素的主动载入脂质体内部,试验结果如表1所示.随着药脂比的逐渐递增,阿霉素脂质体的包封率分别为96.7%、98.7%、96.8%和95.1%,其中药脂比1:10时包封率达到可高达(98.7%).上述试验结果说明,凝胶过滤层析法节脂质体内外水相pH梯度,可有效实现阿霉素的主动载入.考察了采用药脂比1:10制备的阿霉素脂质体在37℃条件下的稳定性,结果如表2所示.在37℃12h内阿霉素泄漏均低于1.0%,48h内药物泄露率低于5%,且脂质体的粒径分布均在119～130nm,未有明显变化.上述结果说明,采用凝胶过滤色谱法调节脂质体内外水相pH梯度,主动载药制得的阿霉素脂质体具有良好的稳定性.
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