CD11c免疫脂质体的制备
2018-11-07 15:32:03
树突状细胞是体内功能较强的专职抗原提呈细胞,在免疫系统对抗原的捕获、处理及提呈过程中居于中心地位,它能同时激发初始性和获得性免疫应答,由于在机体的抗感染免疫及抗肿瘤免疫应答中的作用极其重要而成为近年来免疫学研究的热点.CD11c是相对分子质量为150000的β2整合素家族成员,是确定的DCs特异性表面标记物之一,在小鼠骨髓系和淋巴系DCs,包括DCs前体、未成熟DCs(iDCs)和成熟的DCs(mDCs)均有较高的表达.已有研究表明,CD11c作为DCs表面的免疫靶标,通过其靶向性药物递送系统可以提高DCs对抗原的内吞和有效提呈,促进抗原特异性的体液和细胞免疫应答的产生.
脂质体(lipsomes)是由磷脂双分子层构成,结构与细胞膜相似,它具有携带量大、保护被包封药物免遭降解,易与生物膜融合、缓释、减少用药剂量等特点,已作为一种新型的药物载体得到广泛应用.脂质体同时存在转染效率低、靶向性差等问题.因此,采用化学交联技术将单克隆抗体与脂质体表面结合,利用单克隆抗体的特异靶向性将脂质体及其包裹的药物或抗原特异靶向靶细胞,是提高脂质体靶向性和转染效率的有效方法.利用针对DCs表面CD11c分子的单克隆抗体制备的免疫脂质体,有望通过膜融合和内吞等作用机制,提高脂质体递送效率,进而激发更有效的免疫应答,为后期脂质体载药靶向于DCs细胞提供了新方法.
材料与仪器
RPMI1640培养基、胎牛血清、小鼠重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(mGM-csd)、小鼠白介素4(IL-4,购自Gibco公司);红细胞裂解液(Tris-NH4Cl,自行配制);荧光标记的抗小鼠单克隆抗体APC-CD11c、FITC-CD19(eBioscience公司);2-亚氨基硫烷盐酸盐(2-IT)、胆固醇(CHO)、脂多糖(LPS,购自Sigma公司);氢化蛋黄卵磷脂(EPC-3)、甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺(mPEG2000-DSPE,购自Lipoid公司);马来酰亚胺-甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺(Mal-PEG2000-DSPE,购自Creative公司);200、100nm聚碳酸酯膜,HE-1ml-RT手动挤出器(美国Genizer公司).流式细胞仪(BD公司);HITACHI-7000型透射电镜(Hitachi公司);Zeta Sizer Nano ZS激光粒度分析仪(Malvern公司);SepharoseCL-4B,AKTA prime plus蛋白纯化仪(GE公司);L-2000高效液相色谱仪(Hitachi公司);速离心机(Hitachi公司).
方法与结果
精密称量脂质体膜材料EPC-3、CHO、mPEG2000-DSPE、Mal-PEG2000-DSPE按摩尔比为2:1:0.008：0.002溶于无水氯仿,倒入梨形烧瓶中减压旋转蒸发去除氯仿,加入PBS水化45min,再以薄膜挤出器分别过200nm、100nm聚碳酸酯膜控制脂质体粒径,即得空白脂质体.巯基化试剂2-IT与CD11c单抗摩尔比100.1混悬0.5h,再加入空白脂质体混悬1h即可(图1).以PBS(pH=7.4)缓冲液为洗脱液,将所得的混合液体经Sepharose CL-4B柱分离,收集流分的个峰即为CD11c免疫脂质体,同法也可制得CD19免疫脂质体(CD19-imliposomes)作为对照组.
取制备的空白脂质体和CD11c免疫脂质体,用ZetaSizer NanoZS激光粒度分析仪进行测量.CD11c免疫脂质体形态观察,取上述CD11c免疫脂质体一滴点于反应瓷板的凹槽内,将喷炭铜网膜面朝下放于样品上2min,后取出铜网,用滤纸吸干铜网边缘多余液体,按上述方法再将铜网放于染液滴(2%磷钨)30s,滤纸吸干多余液体后再干燥,置于透射电镜下观察.空白脂质体和CD11c免疫脂质体粒径和电位测定,测得空白脂质体平均粒径为(134.5±2.7)nm,Zeta电位为(-37.9±1.3)mV(图2A、2B),而CD11c免疫脂质体平均粒径为(151.2±1.6)nm,Zeta电位为(-32.0±1.8)mV.
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CD11c免疫脂质体的制备及其体外树突状细胞靶向性.pdf |
