RGD序列修饰的PEG化脂质体对肿瘤细胞靶向作用

2018-11-07 15:50:22

胃癌是世界上第四常见的癌症和恶性疾病的第二致死原因，而对患者实施肿瘤和淋巴结的切除是广大外科医师所追求的，这就需要对肿瘤甚至淋巴结进行有效示踪，由于胃癌及其淋巴结转移相对复杂，本文旨在通过细胞实验初步探索荧光染料对胃癌细胞的靶向示踪效果。整合素α5β1是整合素家族中较重要的成员之一，是纤维连接蛋白(FN)的主要受体。有研究证实细胞表面的整合素α5β₁可以与FN 的Ⅲ₁₀中的ＲGD序列有效识别和结合，在肿瘤的生长、侵犯和转移中发挥着重要作用，其表达与胃癌的分化和转移有关，甚至可能是胃癌患者的独立预后因子。因此有学者用人工合成的ＲGD或含有ＲGD的序列作为靶向配体用于胃癌的研究。脂质体是由英国血液病学家BANGHAM 等首次描述的，近些年来，PEG修饰的脂质体结合靶向配体(ＲGD，西妥昔单抗等)已用于动物模型的肿瘤治疗。本研究中，我们采用脂质薄膜水化/挤出法制备PLS-C6，然后将ＲGD结合到PEG链的末端，从而探讨其对胃癌细胞的靶向结合作用。

材料与仪器

卵磷脂(纯度＞98%，美国Aladdin公司);DSPE-mPEG2000和DSPE-PEG2000-NH2(美国Avanti Polar lipids公司); 胆固醇、香豆素-6(C6)和DMTMM(美国sigma公司);Sephadex LH-20柱(瑞典通用电气医疗集团); 脂质体挤出仪、聚碳酸酯膜(美国Genizer公司) ;H-7650 透射式电子显微镜(日本日立集团);流式细胞仪(美国BD生物科学公司);激光共聚焦显微镜( 德国ZEISS 公司) 。

方法与结果

( 1) PC?CHO?mPEG-DSPE?NH2-PEG-DSPE?香豆素-6 = 200?100?8?2?1(摩尔比) 溶于9ml的2?1氯仿?甲醇混合溶剂中; ( 2) 氮气下，在37℃旋转蒸发除去有机溶剂获得淡黄色的透明脂质膜，真空干燥箱过夜; (3)干燥的脂质膜用PBS水化30～60min，反复冻融6次; (4)悬浮液用脂质体挤出器通过聚碳酸酯膜(100nm)挤出，循环12次; (5)过Sephadex LH-20柱将获取的脂质体置于4℃暗室备用;(6)ＲGD上游离羧基与DSPE-PEG2000-NH2的氨基进行酰胺化反应; ( 7) 检测脂质体的粒径; 用电子显微镜(TEM)观察脂质体的形貌; (8)检测脂质体的紫外吸收光谱，波长从300～900nm;(9)建立C6的浓度标准曲线，然后计算脂质体封装C6的浓度;(10)ＲGD-PLS-C6与细胞结合和内化进行流式细胞分析和激光共聚焦荧光显微镜分析的。

脂质体的合成和特征: 动态光散射法(DLS)测定封装C6的PLS的粒径与ＲGD共轭到脂质体表面后粒径、粒径分散指数差异无统计学意义。透射电镜观察靶向与非靶向脂质体的形貌，粒径较为均匀，大小相似，结果与DLS法测得的粒径结果基本一致。通常脂质体的粒径低于200nm可以依靠EPＲ效应增加药物在肿瘤部位的聚集。同时，脂质体的粒径在与靶向细胞的作用方面也发挥着作用，而受体介导的细胞内吞可以内吞粒径在100～200nm的粒子。PLS-C6和ＲGD-PLS-C6的粒径主要在100～130nm，这显然有助于细胞的被动和主动靶向摄取。流式分析和激光共聚焦成像结果表明ＲGD-PLS与SGC7901结合的荧光强度高于PLS组，而在GES1中两者的细胞荧光无明显差异。所有的实验现象表明由于ＲGD 的介导作用，ＲGD-PLS可以增强特异的细胞结合和细胞摄取。综上所述，我们制备的ＲGD-PLS可作为运输荧光染料的有效载体，并证实了ＲGD-PLS-C6对胃癌细胞SGC7901具有一定的靶向作用。

RGD序列修饰的PEG化脂质体对肿瘤细胞靶向作用的初步研究.pdf

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