纳米荷载药物体外释放及磁共振影像的观察
2018-09-23 15:54:22
目前，纳米载体具有药物靶向和控释特点已成为新型药物输送系统研究的热点。纳米颗粒载药方式，采用特殊材料作为纳米核心，外层脂质中的磷脂为表面活性剂，以保证纳米系统在循环中保持形态和功能的稳定性。同时，脂质层可作为载药基质携带分子探针、治疗药物、影像检查造影剂等发挥作用。全氟碳（perfluorocarbon，PFC）结构与碳氢化合物相似，但所有氢原子被氟原子替代，是一种顺磁性材料。它无色无味，不导电也不助燃，具有一定的挥发性，化学性质稳定，体内代谢不会降解，没有毒性。其很好的化学惰性、较高的生物相容性和稳定性使之被用于人造血液、呼吸窘迫时液态肺灌洗治疗和磁共振分子影像造影剂。
材料和仪器
生物素化磷脂酰乙醇胺购自上海华美生物试剂公司。全氟碳购自美国Gateway SpecialtyChemicals公司。胆固醇、卵磷脂、红花油购自美国Sigma公司。地塞米松磷酸钠和醋酸地塞米松购自上海通用药业，Gd-DTPA购自德国Schering 公司。三氯甲烷为分析纯，甲醇、三乙胺为色谱纯，均购自国药集团化学试剂公司。地塞米松磷酸钠和醋酸地塞米松标准品购自中国药品生物制品检定所。Nano NeBEE型号高压均质机（苏州微流纳米生物技术公司产品），VC-130BP声细胞破碎仪（美国Sonics公司产品），Rotavapor R200旋转蒸发仪德国Bochi公司产品），Nicomp380 Z3000粒度分析仪（苏州微流纳米生物技术公司产品），Avanti 3D低温高速离心机（美国Beckman公司产品），240／740型高效液相色谱仪（ 美国Waters公司产品）。
实验方法
高压均质方法制备全氟碳载药纳米颗粒精密称取醋酸地塞米松药粉100mg或量取0.5％地塞米松磷酸钠溶液4mL，分别加入胆固醇0.6g、卵磷脂1.2g、生物素化磷脂酰乙醇胺20mg、Gd-DTPA 5mL和三氯甲烷30mL通风橱内充分振荡溶解。溶液在旋转蒸发仪内35℃真空水浴制成均匀药膜，再分别加入全氟碳20mL和红花油1mL。细胞破碎仪内声振荡制成微乳，加去离子水定容至100mL。置入高压均质机内，低压（0.7kPa）循环3次，高压（1.5kPa）循环5次，制成全氟碳载药纳米颗粒乳液。粒径分析和zeta电位测定取纳米颗粒乳液100μL，稀释20倍，声分散5min，制得分散液。激光粒度仪进行纳米粒径和zeta电位测试。条件为：HeNe激光波长633nm，电位梯度10V·cm－1，散射角9°，测定温度20℃。扫描电镜观察全氟碳载药纳米药物颗粒形态载玻片声清洗后，分别在异丙醇、甲醇和丙酮中浸洗10min，3次。将纳米样品滴在玻片上，令其自由扩散，室温干燥2h，然后将载药全氟碳纳米样品置于负压（0.1×10－6kPa）中5min，充氩气后喷金4次，每次间隔30s。扫描倍数2000至28000倍。
线性实验精密称取地塞米松磷酸钠和醋酸地塞米松标准品10mg，分别置入50mL容量瓶内。前者用去离子水稀释，后者用甲醇稀释，定容至50mL。精密移取标准品溶液，分别用流动相稀释，地塞米松磷酸钠浓度分别为12.5、6.25、3.125和1.56 mg·L－1；醋酸地塞米松浓度分别为56、28、14、7、3.5和1.75mg·L－1。两者各取20μL溶液注入液相色谱仪，记录峰面积，以峰面积A对药物浓度ρ（mg·L－1）进行线性回归分析。
结果
地塞米松磷酸钠和醋酸地塞米松全氟碳载药纳米颗粒表征分析结果地塞米松磷酸钠全氟碳载药纳米颗粒成球状，大小较为均匀；醋酸地塞米松氟碳载药纳米颗粒表面光整，没有药物结晶。地塞米松磷酸钠和醋酸地塞米松全氟碳载药纳米颗粒的纳米粒径均成单峰样正态分布，平均粒径分别为（224±s6）和（236±9）nm。全氟碳纳米颗粒荷载治疗药物体外溶出实验结果地塞米松磷酸钠全氟碳纳米早期突释现象明显，首日药物释放比率为77.2％。由于地塞米松磷酸钠在释放环境中有一定降解，因此累积释放比率有一定下降，但1wk后仍有约10％药物未完全释放。醋酸地塞米松全氟碳纳米颗粒早期突释程度较轻，约为23.6％，以后逐日释放比率接近线性关系，有较好的缓释特性。磁共振记录各造影剂波谱信号相对强度，依次为：空白对照组630，Gd-DTPA1375，全氟碳590，全氟碳载药纳米颗粒1600，Gd-DTPA＋全氟碳1385。全氟碳载药纳米颗粒信号强度是对照组的2.5倍，比单纯Gd-DTPA信号强度增加16％。
讨论
本研究中的全氟碳纳米颗粒采用高压均质制备方法，在高压（1.4kPa）下将微粉化药物和表面活性剂溶液通过孔隙挤出，局部产生气穴和爆裂，以使药物微粉进一步崩碎。经多次循环，可得到粒径在100～1000nm之间的纳米颗粒。本研究制备的全氟碳纳米颗粒，无论是荷载地塞米松磷酸钠或醋酸地塞米松，平均粒径都小于250nm，两者无显著差异（P＞0.05）。本研究发现， 全氟碳纳米颗粒体系中，水溶性地塞米松磷酸钠药物包封率比脂溶性醋酸地塞米松低，两者差异显著（P＜0.05）。全氟碳纳米颗粒表面的脂质层可促进醋酸地塞米松溶解，药物即使离开纳米表面还能重新被吸附。相反，地塞米松磷酸钠在脂质中溶解度低，一旦离开纳米表面，溶液中的表面活性剂就会占据，因此纳米颗粒乳液中有较多的游离药物。药物包封率和化学性质决定了纳米荷载药物的溶出特性。水溶性药物如地塞米松磷酸钠，在纳米颗粒中保留能力较低，1d约有70％药物溶出。醋酸地塞米松全氟碳纳米颗粒早期突释程度较轻，以后逐日溶出比率接近线性关系。以上实验表明，全氟碳纳米颗粒荷载水溶性药物有较明显突释现象，有利于需要首剂加强的药物治疗，而荷载脂溶性药物，可以保持较长的药物溶出时间，有利于提高药物的生物利用效率。
本实验通过高压均质法制备的生物素化全氟碳载药纳米颗粒，表观特征符合设计要求，全氟碳纳米荷载药物具有较好的缓释性，并可以增加磁共振造影剂的信号强度，提高磁共振检测敏感性，这些结果为进一步的体内研究提供了依据。
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