关于维生素B12光稳定性的研究及其检测方法的建立
2018-09-23 16:04:39
VB12主要由微生物发酵而取得，脱氧腺昔钻肢素、起基钻肢素和甲基钻胶素是发酵得到的有效产物。脱氧腺昔钻肢素和甲基钻肢素对光不稳定，遇光分解转化为瓷基钻肢素，通过光解处理发酵产生的多种钻胶素转化为单一的控基钻肢素。研究脱氧腺昔钻肢素和甲基钻肢素的光解转化较佳条件及光解转化率。
实验仪器
美国Genizer公司Genizer声波细胞破碎仪；Sigma 3K30型高速离心机；Agilent 1100型高效液相色谱仪(二极管阵列检测器)，Beckman C1R(5μm，4.6mmX25cm)色谱柱；Beckman J6-MC型大容量离心机；Sartorius arium 611UF型纯水机；LD-3型数显照度计。
实验方法
配营范基钻肢素、氨基钻胶素、脱氧腺昔钻肢素和甲基钻胶素标准品混合溶液，首先避光操作使用HPLC分析，自然光光解处理后再次进样分析。比较光解处理前后色谱峰变化，通过各个色谱峰的保留时间及光谱吸收图定性光照处理后降解物。取连基钻胶素和氨基钻胶素标准品，用纯水分别配制为0.1mg/ml的溶液，在室内1000LX光强的自然光照射，分别于0、2、4、6、8、10h使用HPLC进样分析。记录连基钻肢素和氨基钻胶素光处理过程中含量变化标准偏差及较终浓度变化，考察其在10h范围内光稳定性。脱氧腺苦钻胶素和甲基钻胶素光解处理后会转化为单一稳定的瓷基钻胶素，系统考察不同光源对脱氧腺昔钻肢素和甲基钻胶素光解动力学情况，并计算光解摩尔转化率。分别配青O.1g/L的脱氧腺苦钻肢素和甲基钻肢素溶液，选用自然光、H光灯、自炽灯为光源研究脱氧腺昔钻胶素和甲基钻肢素的光解动力学及光解转化率，寻找光转化的较佳光源和较短时间。利用光解法快速测定发酵液中VB12含量。取同一批发酵所得菌体以15%混菌体浓度破碎细胞，破碎液沉淀蛋白质后使用4000r/min离心取上清液，较后使用容量瓶定容所得上清液。进样分析前使用0.45μm纤维素滤膜过滤样品。首先避光操作处理样品，HPLC检测维生素B12有效成分之和。然后检测光解转化后发酵提取液中起基钻肢素含量。两种检测方法每组平行做3次，结果取平均值，计算相对标准偏差并比较检测结果。
结果与讨论
光处理后的样品中脱氧腺昔钻肢素和甲基钻肢素光解完全，并且资基钻胶素的色谱峰面积大大增加，氨基钻胶素的色谱峰没有变化，保留时间在起基钻肢素前出现光解降解物峰。将脱氧腺苦钻肢素和甲基钻肢素单独进样分析，使用二极管阵列检测器对光解转化后产物色谱峰进行光谱分析。脱氧腺昔钻肢素和甲基钻胶素的光解转化性质是由其特殊的分子结构决定的。为脱氧腺昔钻肢素和甲基钻肢素在自然光作用下摩尔光解转化率结果。通过1000LX自然光处理，脱氧腺苦钻肢素和甲基钻肢素可完全光解转化为宠基钻胶素，光处理过程中不存在维生素B12有效成分损失。脱氧腺昔钻肢素和甲基钻肢素在白炽灯作用下光解转化的摩尔转化率结果，使用HPLC检测样品光解前后钻肢素浓度。脱氧腺昔钻肢素和甲基钻肢素摩尔转化率分别为99.03%和100.11%，说明二者在白炽灯作用下可完全光解转化为瓷基钻肢素，光处理过程中不存在维生素B12成分损失。对同一批发酵所得菌体测定，计算每升发酵液中维生素B12摩尔含量。使用光解法检测值要高于直接测定法，原因可能是脱氧腺昔钻胶素对光线极为敏感，HPLC直接测定发酵液中维生素B12含量时虽然避光操作，但样品处理过柱中不可避免的会发生少量光解转化，HPLC无法检出光解转化的微量起基钻肢素，导致此方法相对检测值偏低。
结论
脱氧腺昔钻肢素和甲基钻肢素见光迅速分解。通过光解前后光谱吸收图和HPLC色谱峰保留时间判断，脱氧腺昔钻胶素和甲基钻肢素的降解产物都是控基钻胶素。考察不同光源(自然光、H光灯、白炽灯〉对脱氧腺昔钻胶素和甲基钻胶素的光解作用，实验表明光照强度越大光解速率越快，光解过程中维生素Bl2总摩尔含量无损失。通过光解处理，发酵产生的多种形式的钻肢素会转化为单一、稳定的起基钻胶素。在已有HPLC直接法基础上，利用维生素B12各有效成分光稳定性特性，使用HPLC检测光解处理后的细胞破碎液，通过光解转化的程基钻胶素含量反映维生素B12总含量。此方法与HPLC直接测定法相比，色谱条件使用等梯度洗脱，降低仪器损耗，样品处理不需要严格避光，简化了操作条件。此方法在维生素B 12 发酵过程监测方面更具应用价值。考察脱氧腺苦钻胶素和甲基钻肢素的光解转化较佳光源和较短时间具有重要实际意义，实现细胞破碎液的迅速光转化，更为快捷的检测、提取发酵液中维生素B12。此外，光稳定性考察还可为维生素B12 物质的运输保存提供借鉴。
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发酵生产维生素B_12_的检测与提取研究_张玉明.pdf |
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