靶向声造影剂的制备及初次评价
2018-09-23 16:04:31
分子影像学(molecular miaging,MI)是一门快速发展的交叉学科,其目的是活体显示和定量分子及细胞水平变化。至今的研究表明,利用MI能显示活体炎症、细胞凋亡及基因表达。特别吸引人的是,其不仅仅是理想发展中的生物成像探测器,同时也是药物或基因的载体。同一造影剂可以同时发挥诊断、监测疾病情况及其靶向治疗等作用。例如:可以靶向显示血栓、释放溶栓药物及监测血栓的溶解情况等。
声分子成像技术利用靶向造影剂上的配体与靶向组织高亲和性的特点,将声造影剂浓集于靶组织,并通过声显像技术显示靶组织分子水平变化的病理过程。其中靶向造影剂的制备是至今制约声分子影像技术发展的关键因素。本实验拟以赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(KGDS)多肽为配体,制备靶向结合活化血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIa受体的血栓靶向声造影剂(targeted ultrasound contrast agent,TUCA),并检测其靶向结合血栓的特异性。
主要试剂
DSPC和DPPA购自上海东尚实业有限公司;棕榈酸(分析纯级)购自天津市科密欧化学试剂开发中心;荧光标记的KGDS-棕榈酸化合物(FITCKGDS-Palm)购自北京中科亚光生物科技有限公司;全氟丙烷气体(电子级产品,纯度99.999%)购自北京欣明仁医疗器械技术有限公司;聚乙二醇-4000和无水乙醇(均为分析纯级)购自国药集团化学试剂有限公司;泊洛沙姆188(药用级)购自上海昌为。
主要仪器
采用美国Genizer公司粒径测定仪Nicomp380 Z3000测量声造影剂粒径大小及分布（苏州微流纳米生物技术有限公司代理www.willnano.cn）;日本Nikon公司TE2000-S荧光显微镜检测多肽与微泡结合情况;ALOKAA10彩色声诊断仪购自日本ALOKA公司,采用声造影低机械指数实时灰阶造影匹配成像技术实时观察血凝块的回声,并采用Line成像模式存储在仪器硬盘,应用声学定量分析软件脱机分析增强强度。
实验方法
1.TUCA的制备及纯化；
2.KGDS-TUCA一般特性的检测；
3.荧光显微镜检测法；
4.流式细胞仪检测探针与微泡的结合效率；
5.KGDS-TUCA体外靶向性的检测；
6.KGDS- TUCA稳定性实验。
结果与讨论
1999年美国哈佛大学Weissleder较早提出MI的概念,即应用影像学的方法对活体状态下的生物过程进行细胞和分子水平的定性和定量研究。分子特异性探针的构建是MI研究的核心内容。成像效果好的分子影像探针需符合以下要求:(1)分子探针对其靶生物分子具有高度特异性和亲合力;(2)分子探针能反映活体内靶生物分子的含量;(3)分子探针对细胞表面和细胞内的相同的靶生物分子的结合不存在倾向性差异;(4)分子探针具有一定的通透性,能顺利达到目的地;(5)分子探针不会引起机体明显的免疫反应或其他不良反应;(6)分子探针在活体内相对稳定;(7)分子探针在血液循环中有适当的清除期,以满足既能与靶生物分子充分结合又不会有高的血“本底”。分子探针是活体内分子影像成功的先决条件之一。用化学或生物物理方法优化探针, 使之具有合理的体内生物学行为,包括稳定性、高信噪比等, 是探针构建中必须考虑的重要课题。
本实验研究采用磷脂、棕榈酸、泊洛沙姆、聚乙二醇、全氟丙烷等作为原料,制备出安全、稳定、靶向性高的微泡声造影剂。初步采用磷脂作为制备TUCA主要原料:磷脂材料与组织相容性相当高,不干扰人体正常的生理机能,不发生免疫原性反应,已有采用磷脂为材料的商品化声造影剂应用于临床。此外,磷脂作为微泡膜材料,使微泡膜富有弹性,即增加了声的反射,又使微泡具有柔韧性,不易破裂。第二,全氟丙烷惰性气体作为微泡的充填气体:与氧和氮相比较,其在水或血液中的溶解度和扩散率非常低;全氟丙烷气体中的氟-碳结合是自然状态下非常牢固的结合,在体内不易分解代谢,因此全氟丙烷在血液中非常稳定,增加了微泡的稳定性;第三,以棕榈酸为原料之一:棕榈酸能够作为表面活性剂并形成微泡外薄膜,微泡表面覆盖一层薄的棕搁酸壳,其作用在于将气液分开,减慢气体溶解,也增加微泡的稳定性。综上所述,从理论上讲,自制脂质声造影剂具有安全无毒,性质稳定,在体内留存时间长, 造影后可产生明显的造影增强效果的特点。本实验也证实了自制脂质声造影剂具有良好的稳定性:造影剂混悬液体外放置48h后,微泡的粒径及浓度没有显著改变。
本实验采用荧光显微镜、流式细胞仪的方法,证实KGDS连接在微泡表面, 其结合效率高达90.04%。体外靶向及其拮抗实验显示,KGDS-TUCA可以靶向显示血栓,具有与血栓很强的结合能力。本研究采用“声-高速剪切法”制备出KGDS-TUCA;通过体外实验,证实KGDS配体结合效率高,KGDS-TUCA具有很高的稳定性和很强的血栓靶向性,为进一步研究其应用打下了坚实的基础。
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KGDS血栓靶向声造影剂的制备及其初步评价_高峰 _.pdf |
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