高压均质工艺制备壳聚糖季铵盐
2018-04-20 16:58:59
由于其所具有的特殊生物、理化性质，壳聚糖已成为一种理想的新型疫苗佐剂。虽然近年来对它的研究取得较大进展，但进入临床实验和获批的壳聚糖疫苗产品少之又少，壳聚糖的低溶解度严重地阻碍了相关药品的研发生产。为了克服壳聚糖在中性溶液中溶解性差的问题，通过化学改性亲水性基团或直接嫁接聚乙二醇（PEG）等水溶性聚合物，开发出各种壳聚糖衍生物。壳聚糖衍生物佐剂包括文献报道的壳聚糖盐酸盐佐剂，三甲基壳聚糖佐剂，羧甲基化壳聚糖佐剂，甘露糖化壳聚糖佐剂，壳聚糖季铵盐佐剂等。开发壳聚糖衍生物，不仅可以提高其水溶性，还增强材料的阳离子性质，增进壳聚糖与抗原或细胞膜的相互作用，促进抗原吸附、包裹和细胞内化的能力，使得壳聚糖能更广泛地应用于疫苗制剂中。从目前已进入临床的产品来看，壳聚糖微球佐剂总体来说是一种安全、有效、有潜力的疫苗佐剂。
传统制备方法所制壳聚糖微球尚存在一些弊端，需要进一步研究解决。首先利用传统方法制备的壳聚糖微球粒径不均一、结构差异大。微球粒径会影响抗原吸附量和分布，从而影响免疫效果。微球结构差异大，表面微孔的大小差异大，抗原释放的速率调控不一，不利于微球作用机理的研究。其次，微球交联剂多为戊二醛、甲醛等毒性较大的醛类，后期洗涤难以清除，可能残留的外源物质易引起异常毒性和意外不安全因素，生物安全性差。较后，传统方法每批制备出的微球产量小且产率低，批次间不可控地出现差异，不仅难以保障质量，而且无法实现向批量生产的转化。针对以上问题，本文提出了一种新的解决思路。即利用高压均质技术制备出粒径均一，高产率的壳聚糖季铵盐微球。
仪器和原料
BS 110S型电子天平(德国Sartorius公司)；RCT basic磁力搅拌器(德国IKA公司)；3K30高速离心机(美国Sigma公司)；高压均质机NanoDeBEE30-4(苏州微流纳米生物技术有限公司)；循环式真空水泵(巩义市英峪予华仪器厂)；声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Zetasizer Nano ZS动态光散射粒度仪(英国 Malvern Instruments公司)；JSM-6700F冷场发射扫描电子显微镜(日本JEOL公司)；高压灭菌锅(江苏江阴滨江医疗设备有限公司)；CKX41型生物显微镜(日本OLYMPUS公司)；移液器(Eppendorf（Research plus))壳聚糖季铵盐(季铵取代度 40%)(自制)；液体石蜡(AR)、石油醚(AR)、乳酸(AR)、异丙醇、乙醇(AR)(国药集团化学试剂有限公司)；α-β-甘油磷酸钠(α-β-GP，药用级)(山西运城风陵渡开元药化有限公司)；PO-500(日本Sakamoto Yakuhin Kogyo公司)；RPMI-1640细胞培养基(美国Gibico)；白细胞介素-4、巨噬细胞集落刺激因子(美国PeproTech公司)、0.9%生理盐水注射液(石家庄四药有限公司)。
试验方法和结果
称取0.168gHTCC(壳聚糖季铵盐，季铵取代度40%，脱乙酰度95%)溶解于2.5mL0.1mol/L乳酸中，搅拌30 min左右，至HTCC完全溶解。之后向其中加入1.5mL去离子水，搅拌均匀。冰浴条件下，向上述溶液中滴加1mL 0.4g/mL的α-β-GP溶液，交联5min，形成水凝胶，作为水相。将液体石蜡与石油醚按体积比1∶2混合，并加入乳化剂PO-500至终浓度为6.0wt%，作为油相。将配制好的油相倒入烧杯中，再将水相缓慢加入至油相，打开高剪切机以10000r/min的转速搅拌10min制备初乳液。调节均质压力至180Mpa，高压均质3个循环，得到均一乳液。然后将乳液置于装有磁力搅拌子的三角烧瓶中，70℃下油浴固化。同时以150rpm的转速搅拌，完成微球的固化。较后，将固化后的乳液分装至50mL的离心管中，加入沸程60-90的石油醚至总体积为45mL，在滚轴混合器上混合5min，2000rpm离心3min，洗涤3次。再用沸程30-60的石油醚洗涤两次。将得到的沉淀用10mL沸程为30-60的石油醚重悬，移至装有磁力搅拌子的三角烧瓶中，加入10mL20%异丙醇，充分搅拌使异丙醇和石油醚置换。在37℃水浴条件下抽真空，抽至瓶内液体体积为5-8mL之间，结束抽真空。将所得液体移至10mL离心管，用去离子水洗球3次，得到HTCC微球，4℃保存备用。
利用高压均质技术制备的壳聚糖季铵盐微球，粒径均一、分散性良好，该条件下所制得到的壳聚糖季铵盐微球粒径为247±10.67nm，ζ电位+13.85，PDI为0.019。
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壳聚糖微球作为疫苗佐剂的免疫学机制和安全性评价_吴晶晶_.pdf |
“槐叶未归”调
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