马铃薯果胶多糖对酸化乳饮料稳定性的影响
2021-04-06 20:33:35
果胶是一种主要分布于植物原代细胞壁的杂多糖。果胶多糖的结构域包括高半乳糖醛酸（HG）、鼠李糖醛酸I（RG-I）和鼠李糖醛酸II（RG-II），其中HG由线性主链组成，而RG-I和RG-II高度分支。通常，商业上以汞为主的果胶是从柑橘皮或苹果渣中提取出来的，其GalA含量很高（65%）。GalA中甲基化过50%的以汞为主的传统果胶称为高甲基果胶（HMP），否则称为低甲基果胶（LMP）。近年来，其他植物的副产物也被认为可以提取果胶多糖。值得注意的是，马铃薯果肉中果胶多糖的单糖组成与传统的以汞为主的果胶相似，但汞的比例和GalA的含量有很大的不同。与柑橘或苹果果胶不同，马铃薯果肉果胶多糖（PPP）具有支链，主链含有大量半乳聚糖（RG-I的67%）。鉴于其高半乳聚糖含量，基于益生元性能及其在抗癌领域（体外）的作用，PPP被认为具有更高的医疗保健潜力。例如，具有丰富半乳聚糖侧链的马铃薯RG-I果胶多糖在益生菌菌株（例如双歧杆菌和乳酸杆菌）中具有高选择性发酵能力。另一方面，丰富的半乳聚糖侧链末端的β-半乳糖可与半乳糖凝集素-3（一种与癌症相关的凝集素）结合，使其具有比柑橘或苹果果胶更高的抗癌潜力。在过去，具有高度支化结构的PPP由于其较差的凝胶性能而基本上未被开发。由于PPP具有大量的半乳糖侧链和高度的乙酰化，因此PPP具有良好的乳化性能，在食品工业中具有潜在的应用前景。Yang等人发现乙酰基赋予PPP两亲性特征，使其能够存在于水-油界面上，因此显示出比柑橘和苹果衍生果胶更好的乳化稳定性。Khodaei等人强调了多侧链结构对PPP高乳化稳定性的优势。
酸化乳饮料（AMDs）是一种常用的乳饮料，通过添加酸化剂或乳酸菌发酵而成。酪蛋白是牛奶蛋白质的主要成分（80%），其特点是构象灵活，没有特定的二级结构。四个子组分（αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白）通过疏水相互作用结合在一起，并通过胶体磷酸钙（CaP）桥接形成酪蛋白胶束。在牛奶的正常pH值（pH 6.7）下，κ-酪蛋白的亲水链会从酪蛋白胶束表面伸出，在酪蛋白胶束上形成一层毛茸茸的外层，在酪蛋白胶束之间提供空间位阻，使其稳定分散。牛奶酸化过程中，酪蛋白四个亚组分的解离和重排相当复杂，而人们通常认为扩展构象的崩溃和κ-酪蛋白的解离是酪蛋白胶束不稳定的主要原因。
引入阴离子多糖作为稳定剂可以有效避免酪蛋白在AMDs中的聚集，因为阴离子多糖可以吸附在酪蛋白表面，有助于恢复酪蛋白的稳定性。商品化的以汞为主的果胶通常用于稳定AMDs。当果胶参与制备AMDs时，GalA残基中带负电荷的羧基被认为与酪蛋白胶束表面带正电荷的斑块静电结合，而糖链的非吸附部分则在酪蛋白胶束周围以环和尾的形式凸出，从而提供了对抗AMDs的空间位阻酪蛋白聚集。通常，HMP的应用比LMP更广泛，一方面，HMP由于游离羧基含量较低，对酪蛋白胶束表面的静电亲和力较低，另一方面，HMP的钙敏感性比LMP低。大量研究表明，钙桥诱导的果胶链间交联会阻碍果胶与酪蛋白的静电缔合。RG-I为主的PPP含有较少的GalA，因此它具有较低的电荷密度和较高的抗HMP等钙桥交联的能力。此外，PPP上富含中性糖的侧链具有与HMP的低亲和力嵌段相似的作用。Peterson等人发现PPP中的RG-I结构使GalA残基的负电荷沿着主链分布，而富含熵的半乳聚糖侧链将从酪蛋白表面突出，并为酪蛋白胶束贡献更多的空间位阻。然而，他们的研究是在pH值为5.5的条件下进行的，PPP是否能成为AMDs中的稳定剂（pH值为3.6–4.6，低于酪蛋白的等电点）还没有报道。
考虑到低成本和高健康潜力，本研究的主要目的是探讨PPP在稳定AMDs中的行为。基于PPP的结构特点和前人的工作，合理的假设是PPP可以成为AMDs的一个很好的稳定器。通过比较PPP与市售柑桔果胶（HMP、LMP）制备的AMDs的稳定性和物理性质的差异，评价了PPP的稳定性。
材料及试剂
干法马铃薯浆由嘉利源有限公司（中国宁夏）慷慨提供。脱脂奶粉来自恒天然有限公司（新西兰惠灵顿）。商用HMP和LMP（来自柑橘皮，LMP来自HMP与碱的脱酯化反应）购自安德烈果胶有限公司（中国烟台）。标准单糖包括岩藻糖（Fuc）、鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）、半乳糖（Gal）、葡萄糖（Glc）、甘露糖（Man）、木糖（Xyl）、半乳糖醛酸（GalA）购自阿拉丁化工有限公司（中国上海）。其他化学品和试剂均为分析级，购自国药化学试剂有限公司（中国上海）。
将干土豆浆研磨并通过60目筛进行筛分。应用α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶去除残余淀粉。将脱拱马铃薯浆分散在5%柠檬酸一水合物（pH值1.94左右，固液比1:15）中，用10%（w/v）柠檬酸一水合物或0.1mol/L氢氧化钠调节pH值至2。然后，将混合物在88℃加热1小时，并通过G3烧结玻璃过滤器过滤。将回收滤液中和，并向滤液中添加无水乙醇，直到获得40%的较终乙醇浓度。在4℃下保持12h后，通过5095×g离心10min收集沉淀物并用乙醇洗涤两次。沉淀在蒸馏水中重新溶解，透析（8–14 kDa）2天并冷冻干燥以获得马铃薯果胶多糖（PPP）。
用Bradford蛋白质分析试剂盒（Beyotime生物技术公司，上海）测定PPP、HMP和LMP中的蛋白质含量。尿苷酸含量的测定参考Filisetti Cozzi和Carpita。简而言之，以不同浓度（0–0.1 mg/mL）的半乳糖醛酸为标准。将每个样品（PPP、HMP和LMP）完全溶解并制备成0.1mg/mL的溶液。采用氨基磺酸/间羟基二苯法测定糖醛酸含量。根据Zhang at al.，利用高效阴离子交换色谱法（HPAEC）（ICS-5000+，Thermo Fisher Scientific，Fremont，CA，USA）测定单糖组成。简言之，称取2.5 mg PPP、HMP和LMP，分别溶解于2 mL三氟乙酸（2 mol/L）中并在110℃下水解8 h。使用高纯度氮气蒸汽干燥水解产物，并将其溶解在10 mL去离子水中。然后在分析之前通过0.22μm膜过滤溶液。用于分析的色谱柱包括CarboPac保护柱（4×50 mm，Dionex，Thermo Fisher Scientific）和CarboPac PA1分析柱（4×250 mm，Dionex，Thermo Fisher Scientific）。流动相为去离子水（溶剂A）、200mM NaOH（溶剂B）和100mM NaOAc（溶剂C）。在88%A和12%B下开始洗脱15分钟，然后在100%C下洗脱20分钟。使用不同浓度（0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2 mmol/L）的单糖混合物作为校准标准。
AMDs样品的制备基于Peterson等人描述的方法，并进行了一些修改。将PPP、HMP和LMP溶解于一定量的去离子水中，在75℃搅拌30min，得到稳定的溶液。用去离子水和0.02%（w/v）叠氮化钠复配脱脂奶粉制成17%（w/v）的脱脂乳饮料，以防止微生物生长。将脱脂乳饮料在60℃搅拌1h以水合乳蛋白，然后添加1%（w/v）葡萄糖酸-δ-内酯作为酸化剂。酸化16h后，将一定量的PPP、HMP和LMP与AMDs混合，得到8.5%（w/v）的较终奶粉含量，并在较终AMDs中获得0.0%（w/v）到0.5%（w/v）的果胶多糖稳定剂浓度。用10%柠檬酸将较终AMDs的pH调节至4，并通过高压微射流均质机（NanoGenizer，Genizer，Irvine，CA，USA）在40 MPa下进行均质。以PPP、HMP和LMP为原料制备的AMDs经两天贮存后，测定了AMDs的粒径分布。如图所示，观察到粒径在2～10μm之间的单峰分布，表明酪蛋白胶束在没有任何稳定剂的情况下具有广泛的聚集性。加入PPP（0.3%、0.4%和0.5%）后，体积峰由单峰向双峰移动（主峰范围为0.25~2μm，小峰约为4μm）（图2b）。值得注意的是，4μm左右的小峰高度与PPP的浓度呈正相关，这可以用PPP的自聚集来解释。0.3～0.5%PPP对AMDs的粒径分布似乎没有影响，说明0.3%PPP足以覆盖所有的酪蛋白，而血清中非吸附PPP对降低酪蛋白粒径几乎没有帮助。
一定量的HMP和LMP（即HMP的0.3%和LMP的0.3%和0.4%）导致宽的峰，尾部延伸到比空白（大于10μm）更大的直径，表明由于桥联絮凝促进酪蛋白聚集。当果胶稳定剂不足以覆盖所有酪蛋白时，两个或更多的酪蛋白胶束将相互连接并共享一条多糖链，这被认为是一种桥接效应。用PPP（0.3～0.5%）作稳定剂时，未观察到架桥絮凝现象。PPP与酪蛋白之间的静电作用较弱，这可能是PPP很少形成桥来静电连接相邻的酪蛋白胶束的原因。
在不同的amd中，以0.5%HMP的峰值小至。但粒径分布较宽，出现三个体积峰，说明HMP-AMDs中酪蛋白胶束的粒径变化较大。
注：高压微射流均质机是使用金刚石交互容腔的全新一代高压均质机，其金刚石交互容腔具有微孔道对射技术（纯物理作用），可将料液内的微颗粒均质到纳米级稳定均一的状态，料液成分在30000PSI的压力下通过金刚石交互容腔独特设计的孔道（Y型或Z型）时形成音速射流，以此达到纳米级细化均一的稳定粒径分布， 且放大生产机型使用的交互容腔是多通道阵列形式，可用研发均质工艺完美放大。
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