甘草次酸修饰的人参皂苷Rh_2脂质体的制备
2018-11-05 15:38:03
人参皂苷Rh2能有效抑制多种肝肿瘤细胞的增殖，增加肿瘤细胞的凋亡，并诱导其骨架发生变化。但人参皂苷Ｒh2生物利用率低，文献报道将生物利用度低的药物包封于脂质体中，可防止药物在体内快速降解，延缓药物释放而延长药物在体内的作用时间，如果将脂质体经过适当修饰，还能增加药物对靶区的指向性，降低对正常细胞的毒性，提高药物生物利用度。肝癌多发生于肝实质细胞，研究证实该细胞表面存在大量的甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GA)特异性结合位点，脂质体经甘草次酸修饰后，借助活体成像系统检测，药物的肝靶向指数明显提高。为了提高人参皂苷Rh2脂质体(ginsenoside Rh2 liposome，Rh2-L)的主动靶向性，拟通过化学合成的方法将甘草次酸连接在脂质体表面，利用肝细胞表面GA 结合位点的介导，以提高脂质体对肝癌细胞的靶向效率。本实验采用薄膜蒸发法制备人参皂苷Rh2普通脂质体(Rh2-L)和GA修饰人参皂苷Rh2脂质体(GA-modifiedginsenoside Ｒh2 liposome，GA-Rh2-L)，比较这2种脂质体的特性及体外释放差异，通过人肝癌SMMC-7721细胞毒性试验初步研究两类人参皂苷Rh2脂质体的体外抗肿瘤效果，为肝脏疾病的靶向性治疗提供参考。
仪器与材料
Acquity型高效液相(美国沃特世公司)，Delsa Nano HC型粒径测定仪(美国贝克曼库尔特有限公司)，NU-4750E型CO2培养箱(美国Nuair公司)，CMS GmbH型倒置显微镜(德国Leica公司)，5417R型高速离心机(德国Eppendorf公司)，MaxQ4000型空气摇床(美国Barnstead/Lab-Line公司)，Gextruder型脂质体挤出器(美国Genizer公司)，Benchmark Plus型连续光谱酶标仪(美国BIO-RAD公司)。透析袋(截留相对分子质量14000，美国Spectrum 公司)，甘草次酸、人参皂苷Rh2(南京泽朗医药科技股份有限公司，批号分别为20120907-001，20110207-010)，大豆卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000，美国Avanti Polar Lipids公司)，胆固醇(美国Sigma 公司)，葡聚糖凝胶G-50(sephadex G-50，美国Pharmacia公司)，人肝癌细胞株SMMC-7721(上海睿星基因技术有限公司)，RPMI-1640培养基、小牛血清FBS和噻唑蓝(MTT)试剂(加拿大Invitrogen公司)，水为自制纯化水，其他试剂均为分析纯。
方法与结果
采用薄膜蒸发法制备人参皂苷Ｒh2普通脂质体(Rh2-L)。精密称取处方量大豆卵磷脂、胆固醇、人参皂苷Rh2，分别为225，15，8mg，充分溶解于6mL混合溶媒［三氯甲烷-甲醇(1∶1)］中，转移置500mL圆底烧瓶中，于50℃减压旋转40～ 45min直至彻底挥去有机溶媒，用锡纸封住圆底烧瓶，用玻璃棒在锡纸上扎几个洞，置于50℃真空干燥箱中过夜;精密量取50℃的PBS液(pH7.4)10mL注入已真空干燥过的圆底烧瓶中，于50℃水浴中旋转水化，磁力搅拌50～60min，运用脂质体挤出器分别通过0.2，0.1μm水不溶性滤膜各2次，经0.08μm滤膜6次，得乳白色澄清液体，置于4℃冰箱中备用，得Ｒh2-L。称取处方量大豆卵磷脂、胆固醇、甘草次酸(GA，15mg)、人参皂苷Rh2和DSPE-mPEG2000(5mg)，同法制备GA修饰的人参皂苷Ｒh2脂质体(GA-Rh2-L)，置于在水中浸泡过夜的透析袋中，置于水中透析过夜，收集透析袋内GA-Rh2-L，放入4℃冰箱中备用。同法制备空白脂质体，即不加人参皂苷Rh2。
与Rh2-L相比，GA-Rh2-L的包封率、粒径、体外释放率及Zeta电位等理化性质均无显著性差异。Rh2-L和GARh2-L的包封率分别为(91.67±1.05)%，(95.54±2.23)%，粒径(138.6±45.8)，(146.5±48.9)nm，Zeta电位－(12.75±0.34)，－(14.79±0.67)mV，72h的体外释放率(84.67±7.23)%，(89.03±8.61)%。人参皂苷Rh2溶液在12h内释药率达(91.23±5.17)%。细胞用药2d后，GA-Rh2-L对SMMC-7721的半抑制率(IC50)分别为人参皂苷Rh2和Rh2-L的0.524，0.596倍，并呈浓度和时间以依赖关系。结论:甘草次酸修饰不会影响人参皂苷Rh2脂质体得理化性质，还可增加其对细胞的靶向性，增加了细胞毒性，为肝肿瘤的靶向治疗提供了新思路。
 |
甘草次酸修饰的人参皂苷Rh_2脂质体的制备及其体外评价_王琳.pdf |
