靶向叶酸受体的熊果酸脂质体制备
2018-11-06 10:24:59
口腔癌是全球肿瘤发生率中排名第6的常见肿瘤，生存率不到50%。口腔肿瘤的发生90%以上为恶性肿瘤。口腔癌中晚期患者的治疗一般需要进行手术切除，这通常会影响患者面部的美观，造成口腔功能的损伤，严重影响患者的社会交往、进食及语言功能。因此，我们迫切需要设计与开发一种新型有效的肿瘤治疗药物来改善口腔癌临床治疗的局限性。熊果酸为纯中药及植物提取物，具有广泛的生物学效应。同时，它对多种致癌促癌物有抵抗作用，且对多种恶性肿瘤细胞有明显细胞毒及促肿瘤细胞凋亡作用。虽然熊果酸具有良好的抗肿瘤效果，但它难溶于水，口服给药体内吸收差，体外释放度小，体内半衰期短，这些缺点限制了其在药学领域的广泛应用，影响抗肿瘤疗效的发挥。有研究人员利用脂质体这一良好药物载体制备了熊果酸脂质体，开展了临床前研究及I 期临床试验。试验结果显示，熊果酸脂质体在增强其抗肿瘤疗效的同时，提高了晚期癌症患者的生存质量。研究结果同时也表明，熊果酸脂质体在体内缺乏特异性的肿瘤靶向选择性，后期对肿瘤表现出较弱的杀灭作用。因此，增加熊果酸脂质体的肿瘤组织主动靶向性将有助于提高其肿瘤抑制效率。叶酸受体( FＲ)是一种跨膜单链糖蛋白，在许多常见恶性肿瘤细胞的表面均有过量的FＲ表达，在正常组织中很少表达，因此具备很好的肿瘤组织特异性。基于这一理由，本研究拟采用叶酸受体靶向治疗技术，以具备良好化学稳定性的叶酸-聚乙二醇-胆固醇的半琥珀酸盐作为靶向材料，制备新型的叶酸受体靶向熊果酸脂质体。基于人源性口腔表皮癌KB细胞上多表达叶酸受体的特点，希望通过这一技术，将包裹熊果酸的主动靶向型脂质体定向聚集于肿瘤部位，增加肿瘤靶区组织里的药物浓度，在改善熊果酸临床使用局限性的前提下，提高其抗肿瘤效应。
仪器与材料
N 1100S WD旋转蒸发仪(EYELA，上海普渡生化科技有限公司);DZF 6090真空干燥箱(上海林频仪器有限公司); Gextruder-10ml脂质体挤出器(美国Genizer公司);IX71荧光倒置显微镜(日本Olympas公司);FACSCalibur流式细胞分析仪(美国Becton Dickinson Biosciences 公司);高效液相色谱仪(600泵、2487紫外检测器、717自动进样器，美国Waters公司);Sappphire ＲPC18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm，美国Sepax色谱公司);Zeta PALS激光粒度及电位分析仪(美国Brookhaven InstrumentsCorporation);酶标仪(芬兰Thermo Labsystems公司);Forma311二氧化碳培养箱(美国Forma 公司);净工作台(苏州净化设备厂);SS 325全自动高压灭菌锅(日本TOMY公司);H6 1微型电泳槽(上海西巴斯生物科技公司);化学发光成像分析系统(美国Gene公司);Sepharose CL 4B凝胶柱填料(美国Sigma-Aldrich Chemical Co．)等。
熊果酸(AＲ级，纯度95%，华中科技大学同济医学院药学院);叶酸-聚乙二醇-胆固醇的半琥珀酸盐(华中科技大学同济医学院药学院) ; 氢化卵磷酯( 美国Avanti Polar Lipids Inc．);胆固醇(美国Acrosorganics公司);聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(mPEG2000-DSPE，德国Lipoid公司);氯仿(CHCl3)、二甲基亚砜(DMSO)(中国国药集团化学试剂有限公司);青霉素、链霉素、胰蛋白酶(碧云天生物科技有限公司);ＲPMI-1640 培养基( 美国Sigma-AldrichChemical Co． ) ; FBS 胎牛血清( 杭州四季青生物科技有限公司);谷氨酰胺( 美国SIGMA公司);3-( 4，5-二甲基噻唑-2) -2，5-二苯基四氮唑溴盐( MTT，飞弈科技有限公司);Annexin V/PI 凋亡试剂盒(联科生物科技有限公司);bcl-2 兔多克隆抗体(#2870)、bax兔多克隆抗体(#2772)、caspase-3兔多克隆抗体(#9665) 、二抗Anti-rabbit IgG，HＲP-linked Antibody(#7074)(Cell Signaling Technology)等。
方法与结果
称取氢化卵磷酯、胆固醇、mPEG2000-DSPE 和叶酸-聚乙二醇-胆固醇的半琥珀酸盐(摩尔比6.5∶3∶0.45∶0.05)以及一定质量的熊果酸(药物∶脂质=1∶20)于梨形瓶中，加入少量的氯仿使之完全溶解，37℃减压旋转蒸发除去有机溶剂直至梨形瓶内壁上形成一层脂质薄膜。在室温下，置于真空干燥箱中过夜除去残余的有机溶剂。用pH 6.8的磷酸盐缓冲液(PBS)于60℃水化脂质膜。再将水化后的脂质体于60℃水浴中，在通氮气的条件下，用高压挤出器过0.22 μm滤膜整粒5次。即得乳白色半透明的靶向熊果酸脂质体-PEG-LUA)。熊果酸脂质体(PEG-L-UA)的制备方法同上，处方.中不添加叶酸-聚乙二醇-胆固醇的半琥珀酸盐。
取新制备的脂质体原液500μL，过Sepharose CL-4B凝胶柱，以PBS作为流动相分离未包封入脂质体内的游离熊果酸，收集脂质体部分加流动相破乳(可于60℃适当加热)，直至脂质体溶液完全澄清，用于测定所包封的药物含量。另取未过凝胶柱的脂质体混悬液500μL，破乳，用于测定总的药物含量。包封率(EE:entrapment efficiency)=包封的药物含量/总的药物含量×100%。分别取新制得的脂质体各1mL加PBS稀释至合适浓度(1∶30，v/v)，混合均匀后，使用动态光散射激光粒度分析仪DelsaNanoseries测定脂质体粒径和粒度分布，测试温度设定为25℃，重复5 次，每次测试时间1min，取平均值。同样处理的脂质体样品放置电位分析仪Zeta PALS中测定各种脂质体的Zeta电位，重复5次，取平均值。与普通熊果酸脂质体(PEG-L-UA)相比，本研究所制备的熊果酸主动靶向脂质体粒径、分散系数、包封率及电位等理化性质无显著差异性，粒径约150～160nm、颗粒分散均匀、呈负电性，熊果酸包封率大于85%。
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靶向叶酸受体的熊果酸脂质体制备及其对人口腔肿瘤的抑制作用_杨光.pdf |
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