云芝胞内糖肽抗酒精性肝损伤组分的纯化
2018-09-07 10:40:15
云芝多糖是一种真菌多糖，其包括从云芝子实体中提取的粗多糖（CVPS）和云芝发酵液中的胞外多糖，和从液体发酵得到的菌丝体中分离提取的蛋白结合多糖（PSK或PSP）。CVP的分子量在1300kDa左右，经过纯化后的云芝子实体多糖是一种含有β-糖苷键的葡聚糖，连接方式为β（1→3）和β（1→6）。其代表商品为云芝肝泰，它是云芝子实体经热水浸提、乙醇沉淀后制备的多糖粗提物，临床主要治疗慢性乙型肝炎，药理活性的研究多还在粗提物的水平。云芝胞外多糖不含肽，以β（1→3）为主链，β（1→3）及β（1→6）为支链，主要的单糖为D-葡萄糖，含量达99.2%。
云芝胞内糖肽具有许多药理作用，如：保肝解毒、抗肿瘤作用、增强免疫功能、抗氧化作用以及其他一些药理作用。云芝胞内糖肽对慢性乙型肝炎、肝硬化等肝脏疾病有着预防和治疗作用。研究表明，云芝糖肽对化学肝损伤、免疫肝损伤和酒精性肝损伤均有一定疗效。从下表可以看出，云芝多糖对肝损伤治疗作用方面的研究较少，并且均局限于云芝子实体多糖的粗提物，没有涉及云芝胞内糖肽对肝损伤的研究；另一方面，研究大多涉及化学性肝损伤和免疫性肝损伤，云芝胞内糖肽对酒精性肝损伤的作用也鲜有报道。因此，本文研究云芝胞内糖肽中的抗酒精性肝损伤活性组分，以期得到有活性的纯化组分。
多糖的提取方法有溶剂提取法（如热水提取法、酸碱提取法、临界流体萃取法等）；生物提取法（如单一酶提取法、复合酶解法）；物理提取法（如声提取、微波提取、高压提取法等）。根据云芝胞内糖肽的原料差别和对多糖质量要求的不同采用不同的方法。目前，工业生产中多采用热水浸提的方法法从云芝菌丝体中提取云芝胞内糖肽粗产品。但由于提取时间长、提取温度高，容易造成多糖结构和活性的破坏。现如今，均质技术在饮料、乳品、食品、化妆品和化工等行业得到广泛应用。该技术在高压条件下，调节限流缝隙而引起失压、膨胀、爆炸、剪切和高速撞击等综合效应，将液体中的颗粒粉碎，使直径仅为0.05~0.2μm，这个过程集中了声波粉碎、胶体磨、球磨功能，颗粒面积的增大以及高压带来的综合效应，极大地加速了可溶物质在溶剂中的渗透和扩散，可大大提高真菌、植物等中的有效成分提取得率，对活性成分几乎无破坏。据报道，高压均质提取能有效提高云芝胞内多糖的提取得率。因此，本论文采用高压均质的方法来提取云芝胞内糖肽，并以云芝胞内糖肽的抗酒精性肝损伤活性多糖组分指标做比较，以期高效制备出高得率并具有抗酒精性肝损伤活性的精制云芝胞内多糖。
原料及仪器
酶标仪(美国Thermo公司)、高压均质机NanoDeBEE45-4 (苏州微流纳米生物技术有限公司)、高速冷冻离心机(日本Hitachi公司)、旋转蒸发仪(德国Heidolph公司)、冷冻干燥机(美国LABCONCO公司)、Synergy纯水系统(美国Millipore公司)、RCT型磁力加热搅拌器(德国IKA公司)、Avant蛋白纯化系统(美国通用电气医疗集团)。云芝菌株（江苏神华药业有限公司），菌株培养于PDA斜面培养基，4°C保存。
种子培养基（g/100mL）：葡萄糖3，酵母粉0.3，花生饼粉1，KH2PO40.1，MgSO40.06，pH自然； 发酵培养基（g/100mL）：葡萄糖1，蛋白胨0.4，KH2PO40.3，MgSO40.15，pH 4.5。
试验方法
利用5L发酵罐制备云芝和猴头液体深层发酵菌丝体。云芝发酵条件：接种量10%，温度28°C，转速180rpm，通气量1v/v·m，培养3d；猴头发酵条件：接种量10%，温度28°C，转速200rpm，通气量1v/v·m，培养4d。发酵结束后，8000rpm离心10min获得云芝和猴头菌丝体，计算含水量，用于后续实验。
分别称取20g云芝、猴头发酵菌丝体（已计算含水量）于300mL去离子水中，利用高压均质机进行破碎（均质条件已优化），均质压力为180MPa，均质次数为3次，利用循环冷却水控温；均质结束后8000rpm离心10min，上清浓缩后加入三倍体积无水乙醇，4°C过夜，沉淀冷冻干燥后得云芝胞内多糖和猴头胞内多糖。
试验结果
本研究采用较优条件下的动态高压均质提取法提取云芝胞内糖肽和猴头胞内多糖，并与声提取和传统的热水提取方法做比较。经动态高压均质提取、声提取和热水提取后的云芝胞内糖肽提取得率分别为20.21%、11.19%和10.76%，猴头胞内多糖的得率分别为16.42%、5.12%和4.81%。经高压均质提取的云芝胞内糖肽提取得率可高达，比声提取和热水提取高出了将近2倍，而猴头菌胞内多糖的提取得率高出了3倍。动态高压均质提取法凭借其过程强大的剪切力、撞击力和空化效应，使得多糖充分、完全地释放到胞外溶剂中（水），大大提高了提取得率。
 |
云芝胞内糖肽抗酒精性肝损伤组分的纯化_表征及高效制备_.pdf |
“槐叶未归”调
上一页：玉米秸秆纳米纤维素的制备及表征
