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酸性条件下花生蛋白的亚基解离规律及乳化

2018-09-07 16:52:45

花生属于豆料，一年生草木，又名落花生、地豆、地果，主要生长在热带和亚热带、以及地中海沿岸，约在100多个国家广泛种植。作为我国重要的油料作物，花生的总产量自20世纪90年代中期过印度后，一直保持世界的位置。花生可治疗营养不良，脾胃失调，贫血，咳嗽痰喘等症状，具有较高的医疗药用价值。花生蛋白的生物价为58，其蛋白效率比值为1.7。与其它植物蛋白相比，花生蛋白的消化率很高，消化系数可达90%，易被人体吸收利用，其中赖氨酸的有效利用率高达98.96%，比大豆高出20%；而与菜籽，棉籽蛋白相比，花生含有较少的毒性物质；与大豆蛋白相比，花生蛋白的功能与之较为接近，却更易吸收；花生蛋白的不消化糖、棉籽糖和水苏糖含量只相当于大豆蛋白的1/7，也不易产生食用大豆蛋白后出现的腹胀、嗝气现象。因此花生蛋白的生物学价值比大豆高得多，被认为是一种极具开发潜力的乳糖不耐症消费者的蛋白基料和牛乳等动物奶类的代替品。作为一种重要的油料蛋白资源，花生的蛋白质含量为21%以上。对170种花生进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，发现花生分离蛋白能分离成8个明显的条带。其中花生球蛋白共4个条带，分子量分别为40.5ku、37.5ku、35.5ku 和23.5ku；花生伴球蛋白Ⅰ有3个条带，分子量18ku、17ku或15.5ku；花生伴球蛋白Ⅱ有1个条带，分子量为61ku。
  花生蛋白中含丰富的必需氨基酸，不同的花生蛋白组分均含有18种氨基酸，其中含量较高的是天冬氨酸、精氨酸、谷氨酸[7]。除甲硫氨酸含量较少外，赖氨酸和苏氨酸含量接近联合国粮农组织（FAO）标准，苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸含量甚至高于FAO标准。
  花生蛋白中90%为盐溶性蛋白，其中包含73%的花生球蛋白（14S，类似大豆球蛋白11S）、6%的伴花生球蛋白Ⅰ（7.8S，类似于7S豌豆球蛋白）和21%的伴花生球蛋白Ⅱ（2S）。
  目前，花生球蛋白有两种通用的提取方法：
   1.冷沉淀法：利用花生球蛋白的低温冷沉特性，分离出不同的花生蛋白组分。将脱脂花生粉溶于0.2MpH7.9磷酸盐缓冲溶液中，搅拌4h后在4℃的流动水下透析，沉淀物为花生球蛋白，上清液为伴花生球蛋白。通过酸沉或冻干制备得伴花生球蛋白。
  2.硫酸铵沉淀法：此方法是在一定的缓冲溶液中，利用0-40%的硫酸铵将花生球蛋白从溶液中析出。Jones和Horn研究发现，硫酸铵饱和度为40%时，能完全沉淀出花生球蛋白。当硫酸铵饱和度高达70%~80%时，能沉淀出伴花生球蛋白。

仪器和原料
  多功能全波段扫描仪，Thermo scientific生产；pHS-25数显pH计，瑞士梅特勒-托利多公司生产；电泳槽，美国Bio-Rad生产；Sorvall legend micro 17R离心机，Thermo scientific生产；高速冷冻离心机CR22N，日本HITACHI 公司生产；Lumina荧光分光光度计，Thermo scientific生产；Azure C300化学发光成像系统，Azure Biosystems生产；Nano-ZS&MPT-2Zeta电位及纳米粒度分布仪，英国Malvern公司生产。激光动态粒度扫描仪Zetasizer Nano ZS，英国Malvern公司生产；TCS SP5激光共聚焦显微镜，德国莱卡仪器公司生产；高压均质机NanoDeBEE（苏州微流纳米生物技术有限公司）。
  低温脱脂花生粕，山东禹王实业有限公司生产；玉米油，益海嘉里有限公司生产；牛血清蛋白（BSA），北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司生产；BCA试剂盒，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司生产；尼罗红、尼罗蓝染料，美国Sigma公司生产；叠氮钠，成都市联合化工研究所；其它试剂为分析纯。

试验方法
  取一定量花生粕，料水比1:15混合搅拌，用2mol/L NaOH调节pH至8.0，浸提2h后，8000r/min离心15min，过滤取上清液，用2mol/L调节pH至4.5，搅拌30min，酸沉后8000r/min离心15min，过滤除去清液，收集沉淀称重，按1:5比例加水复溶，用2mol/L的Na OH调节pH至7.0，透析24h，冷冻干燥得PPI。
  取一定量冻干后的PPI溶解于去离子水中配制成2%的PPI溶液，搅拌2h后，用2mol/L HCl分别调节pH至1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、7.0，搅拌2h后分别取样进行溶解度及内源性荧光分析，上述样品稀释至0.1%进行 Zeta电位及粒径测定；用2mol/L的NaOH将不同pH处理2h后的PPI溶液回调至中性，取样进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。取PPI溶液用2mol/LHCl调节pH到2.5后，分别处理0、10、20、30、60、90、120、150min后调回中性，取样进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。取pH2.5的PPI溶液，分别添加0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2mmol/L的Na Cl，处理2h后用2mol/L NaOH回调至中性，取样进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。
  分别配制0.25%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%、2.50%、3.00%(w/w)的pH2.5（PPI-2.5）、pH7.0（PPI-7.0）和pH2.5处理后回调中心的花生蛋白溶液（PPI-2.5-7.0），搅拌2h后，加入0.02%的叠氮钠，4℃水化过夜。将玉米油添加到蛋白溶液中，使油相比Ф达到0.2。10000rpm剪切1min后，再用高压均质机140MPa均质一次，分别制得 PPI-2.5、PPI-7.0、PPI-2.5-7.0乳液。
  新鲜乳液及常温储藏24h后乳液的粒径分布和平均粒径大小可利用马尔文粒度分布仪测定。以乳液相对应pH的去离子水及1%SDS作为乳液的分散剂。分散相的折光率为1.33。

试验结果
  乳液粒径d4,3代表乳液粒径的平均体积。乳液粒径d4,3越小，其乳化稳定性越强。经酸处理后的花生分离蛋白（PPI-2.5、PPI-2.5-7.0、PPI-7.0）乳液的d4,3表明，经过pH2.5的酸性条件处理后，PPI-2.5乳液的d4,3值明显小于中性条件，说明酸性条件下的蛋白乳化性能更佳。推测其原因可能是酸性环境中的PPI乳液，其油滴表面的蛋白膜粘性比中性环境的强，进而形成更紧密的网络结构，使得乳液粒径更小。虽然PPI-2.5-7.0乳液的油滴粒径高于PPI-2.5的，但明显低于天然花生蛋白PPI-7.0的粒径（p<0.05），这是由于酸处理后的PPI 结构逐渐展开，暴露出大量的疏水性基团，回调至中性条件也无法恢复其原始结构，能快速地扩散到油滴表面形成蛋白膜，故乳化能力有所提高。
  另外发现较低的蛋白浓度范围内，PPI-2.5的油滴粒径随浓度的提高而显著增大（p<0.05），从6.41μm下降为1.35μm。当蛋白浓度高于2.00%后，PPI-2.5的粒径稳定在1.35μm左右，不再跟随浓度变化；同等条件下，酸处理后回调至中性环境的PPI-2.5-7.0，随蛋白浓度的升高，其油滴粒径从18.80μm下降至2.90μm。当蛋白浓度高于2.00%后，PPI-2.5-7.0的油滴粒径稳定在2.33μm附近。室温下保存24h后检测，酸处理后的花生蛋白的油滴粒径变化不大。

酸性条件下花生蛋白的亚基解离规律及乳化特性研究_辛佩贤.pdf

“槐叶未归”调