深海放线菌破碎提取产生的具有降血脂活性的芳香酸和亮氨酸衍生物
2022-04-25 15:45:09
高脂血症是指血脂水平升高，是心血管疾病的危险因素，包括冠状动脉粥样硬化、心血管疾病、心力衰竭和其他代谢性疾病。高脂血症也被称为甲状腺功能减退和慢性肾功能衰竭等几种病理状况的恶化，全球每年约有1200万人死于高脂血症。目前，用于降低血脂水平的药物主要包括他汀类药物（阿托伐他汀、洛伐他汀等）、贝特类药物（苯扎贝特、利贝特等）和树脂类药物（胆苯丙胺、科尔斯蒂波尔等）。尽管如此，这些合成药物通常与一些严重的副作用有关，如腹泻、恶心、胆结石、肌炎和肝功能异常。因此，迫切需要从天然产物中寻找具有更高治疗价值和更少耐受性副作用的新型降脂剂。在过去几十年中，许多海洋衍生活性成分已被测试并证明具有降脂或降血脂作用，如海藻多糖、海藻多酚、油性鱼类的多不饱和脂肪酸和鱼蛋白。海洋微生物已显示出生产大量活性物质的潜力，包括抗菌、抗病毒、抗氧化剂以及细胞毒性化合物。海洋极端微生物倾向于产生引人入胜的新型生物活性次级代谢物；在我们的研究中，放线菌菌株中获得了六种新的芳香酸，三种新的亮氨酸衍生物其中含有一种不同寻常的肟部分，以及两种已知化合物。通过详细的NMR、MS、实验和计算的电子圆二色谱光谱分析确定了1-9的结构，包括绝对构型。评估化合物1-9的抗菌和细胞毒性活性，以及它们对HepG2细胞内脂质积聚的影响。化合物3和4在10μM时对细胞内脂质积累具有较强的抑制活性。
使用ODS柱（YMC pack ODS-A，10 mm×250 mm，5μm）进行半制备HPLC（安捷伦科技，1260 Infinity II系列）。柱色谱（CC）分别在硅胶（200-300目；中国青岛海洋化工集团有限公司）、Sephadex LH-20（美国新泽西州皮斯卡塔韦阿默森生物科学有限公司）和十八烷基硅基硅胶（日本京都YMC有限公司；50μm）上进行。在254 nm紫外光下，在TLC（中国青岛海洋化工厂）上检测到斑点。核磁共振谱是在Bruker Avance-600 MHz光谱仪（美国马萨诸塞州比尔里卡市Bruker）上以四甲基硅烷为内标物获得的。HR-ESI-MS光谱记录在Bruker miXis TOF-QII质谱仪（美国马萨诸塞州比尔里卡市Bruker）上。用Perkin Elmer MPC 500（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）旋光仪测定旋光度。UV、IR和ECD光谱分别记录在岛津UV-2600 PC光谱仪（日本京都岛津）、IR亲和-1光谱仪（日本京都岛津）和Chirascan圆二色谱光谱仪（英国萨里郡皮革头应用光物理）上。人造海盐是一种商业产品（广州海力水族科技有限公司，中国广州）。使用高压微射流均质机NanoGenizer（美国加利福尼亚州 Genizer LLC）破碎细胞。
将几圈该菌株的细胞接种到含有150毫升种子培养基（麦芽提取物1%，酵母提取物0.4%，葡萄糖0.4%，pH 7.2）的500毫升锥形烧瓶中，然后在180转/分的旋转振动筛上培养，28◦C培养48小时作为种子培养。然后，将2L种子培养物接种到含有40L培养基（豆粕1%，玉米浆0.5%，葡萄糖0.5%，酵母抽提物0.1%，甘油2%，肉抽提物0.2%，CaCO3 0.2%，MgSO4 0.01%，pH7.2）的65L发酵罐中。在180 rpm和28 rpm下培养后◦C持续80小时，以4000 rpm的转速离心细菌培养液。然后，使用声波处理装置将菌丝体和上清液破碎15分钟，并分别用等体积的乙酸乙酯提取三次。然后在真空下浓缩有机提取物，以提供粗提取物。将EtOAc在真空中浓缩以产生有机提取物（约51 g）。
Nanogenizer30K作为美国Genizer公司研发的实验型微射流均质机,是配备金刚石交互容腔的新一代高压均质机，也成为纳米均质机，可高达操作压力200MPA,设计流量100ml/min,主要用作高校,研究所,企业实验研发使用，可以用于细胞破碎提取物质的应用,比如大肠杆菌、酵母细胞藻类细胞和真菌细胞等各类细胞的破碎使用。
