聚乙烯亚胺与磷脂酰胆碱脂质体对膜结构的影响
2019-10-12 12:49:35
聚乙烯亚胺(PEI)因其高电荷密度和独特的"质子海绵效应"而具有良好的转染效率,分子量分别为25000的支化PEI和22000的线性PEI被认为是高分子基因载体的“黄金标准”.在实际应用中,生物医用材料不可避免地与各种生物大分子、细胞、组织和器官接触.研究表明,PEI材料具有不同程度的细胞毒性,然而这些细胞毒性评估多数是建立在体外细胞活性分析(如MTT)基础上的,通常在利用材料处理细胞后4~8h进行,其结果只能反映细胞对材料的急性应答,并不一定代表载体材料安全性的真实情况.PEI可通过静电作用将核酸长链压缩形成复合物纳米颗粒,其表面正电荷有利于复合物颗粒与细胞质膜的相互作用,从而启动胞吞或者胞饮作用进入细胞并形成内涵体和溶酶体;也有研究者认为复合物颗粒通过PEI介导的在细胞膜和溶酶体膜上形成的纳米孔洞进入细胞质.由此推断PEI的毒性与其对生物膜的扰动有关.脂质是生物膜的主要成分,由于PEI的氨基易于质子化而带正电荷,目前的研究主要关注PEI与阴离子脂质体的相互作用,而对PEI与中性脂质体如磷脂酰胆碱脂质体的相互作用及对脂膜结构的研究报道尚不多见.
材料与仪器
二油酰磷脂酰胆碱(DOPC,冻干粉)、支化聚乙烯亚胺(PEI)和8-苯氨基萘-1-磺酸(ANS,纯度>98%)购自美国Sigma公司;N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3二唑-4-氨基)-磷脂酰乙醇胺三乙胺盐(NBD-PE)和N-丽丝胺罗丹明B-磷脂酰乙醇胺三乙胺盐(Rh-PE)均为分析纯,购自美国Molecular Probes公司;钙黄绿素(分析纯)购自天津博迪化工股份有限公司;Triton X-100(分析纯)购自美国Amresco公司;槲皮素(Que,生化纯)购自国药集团试剂有限公司;分析所用溶液和储备液使用磷酸盐缓冲液(PBS,10mmol/L,pH=7.4)配制.
UV-2501PC型分光光度计(日本Shimadzu公司);HE-1ml-RT型脂质体挤出器(美国Genizer公司);Zetasizer Nano ZS纳米粒度电位测定仪(英国Malvern公司);RF6000型荧光分光光度计(日本Shimadzu公司);MicroCal ITC200型等温滴定量热仪(美国GE公司).
方法与结论
脂质体的制备称取一定量的DOPC溶解于6mL V(氯仿):V(甲醇)=2:1的混合溶剂中,于45℃旋转蒸发去除溶剂,用氮气冲刷磷脂膜30s,真空下干燥过夜;加入5mL PBS 缓冲液进行水化,声波分散后,利用脂质体挤出器挤压通过100nm碳酸酯膜21次.所得大单层脂质体(LUV)用PBS缓冲液稀释至100mL,根据Stewart法测定磷脂含量,于0~5℃保存备用.
将NBD-PE和Rh-PE与DOPC按摩尔比0.8:100混合,参照上述方法制备NBD-PE和Rh-PE共标记脂质体.钙黄绿素负载脂质体采用相同方法制备,区别在于使用80mmol/L的钙黄绿素溶液水化,并利用Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱分离除去未包封的钙黄绿素,以PBS缓冲液稀释脂质体分散液至50μmol/L.
粒径和zeta电位的测定将PEI储备液以PBS缓冲液稀释至所需浓度,加入脂质体储备液并混合均匀(DOPC终浓度为50μmol/L),于25℃测定脂质体的流体动力学直径和zeta电位.相同条件下至少测定3次,结果取平均值.
等温滴定量热分析等温滴定量热实验在25℃下进行PEI溶液(5.0mg/mL)和DOPC脂质体分散液(750μmol/L)在实验前配制,并利用HCl或NaOH溶液(0.1mol/L)调节pH=7.4,配制好的溶液经脱气处理后分别装入滴定针和样品池.滴定过程中,PEI溶液由滴定针逐滴滴入测量池,每次滴定体积为1μL,时间间隔90s,搅拌转速300r/min,滴定过程的热效应由仪器自动记录.在相同条件下将PEI溶液滴定至PBS缓冲液中,得到PEI的稀释热效应.
PEI浓度对DOPC脂质体粒径的影响
可见,PBS缓冲液中DOPC脂质体的粒径为155nm,添加少量PEI25k(<0.03mg/mL)对脂质体的粒径无明显影响.随着溶液中PEI25k浓度的增加,脂质体的粒径先急剧增加后迅速减小,在约0.05mg/mL时达到大至值,当c(PEI25k)≥0.075mg/mL时,脂质体的粒径基本保持不变,且与无PEI缓冲液时脂质体粒径相近.在含PEI10k的缓冲液中DOPC脂质体的粒径也有相同的变化规律,但是与PEI25k相比,PEI10k对脂质体粒径的影响较小,当PEI25k和PEI10k的浓度为0.05mg/mL时,脂质体粒径分别为291和201nm.PEI对DOPC脂质体粒径的影响随着PEI分子量的减小而降低,在实验浓度范围内(0~0.15mg/mL),含PEI1.8k的缓冲液中脂质体的粒径几乎保持不变.
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