高压均质法提取黑木耳多糖工艺的探讨
2018-04-21 09:52:19
现代社会中人类接触到越来越多的辐射，除了地壳中放射性核素、宇宙射线等自然辐射外，还会受到工业核污染、医疗放射治疗的辐射以及日常生活中的电器辐射，如手机、电脑、电磁炉、微波炉等。电离辐射可以直接攻击基因组DNA，导致单双链断裂、碱基损伤、簇损伤，还可以诱发靶组织产生活性氧簇，引起生物膜脂质过氧化、蛋白质变性，从而导致细胞损伤、细胞功能障碍和死亡。长期小剂量或短时间大剂量的天然辐射以及人工辐射会通过不同的方式影响人体健康，产生杀伤细胞、抗增殖、亚慢性或慢性副作用，严重情况下，会造成人体器官和系统的损伤。黑木耳是一种珍贵的食药兼用胶质真菌，富含生物活性多糖，多糖经硫化处理后能成为现今较好的防辐射物质，但现有的工艺使得黑木耳多糖提取率低、水溶性差，高压均质机能够充分破碎流体中颗粒，使颗粒面积增大，结合高压条件带来的综合效应，可以极大加速可溶物的扩散，因此对高压均质法提取多糖进行研究。
仪器和原料
高速万能粉碎机FW100（北京光谱仪器有限公司）电子分析天平R200D（德国赛多利斯公司）NanoDeBEE高压均质机（美国BEE公司）胶体磨JM80-2A（温州市胶温州市胶体磨厂）台式离心机TDL-5（上海科兴仪器有限公司）可见分光光度计721（天津市普瑞斯仪器有限公司）乌氏毛细管粘度计MC（中国医药(集团)上海化学试剂公司）酶标仪Model 550（日本BIO-RAD公司）数显恒温多头磁力搅拌器HJ-6A（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）旋转蒸发仪R-1005（郑州长城科工贸有限公司）数控声波清洗器KQ-500KE（昆山市声仪器有限公司）
小兴安岭野生黑木耳、苯酚、浓硫酸、30%过氧化氢、ABTS、DPPH、95%乙醇、硫酸铵、正丁醇、氢氧化钠、RPMI-1640培养液、瑞氏-姬姆萨复合染液、印度墨水、三氯乙酸、生理盐水。
试验方法
将黑木耳子实体用高速万能粉碎机粉碎，过60目筛，然后用石油醚浸泡24h，脱脂，40℃烘干至恒重，得到黑木耳干粉。称取一定质量的黑木耳干粉，按料液比1:80加入蒸馏水，胶体磨研磨10min，然后将高压均质机的均质压力调至80、120、160、200MPa，分别均质2、5、10、15、20个循环，4000r/min离心10min，量取上清液体积，计算多糖得率。
0.5%明胶溶液：称取2.0g明胶溶于400mL蒸馏水中，4℃冰箱保存备用；氯化钡-明胶溶液：称取0.5g氯化钡溶于100mL、0.5%明胶溶液中，4℃冰箱保存备用；0.6mg/mL硫酸基标准溶液：准确称取干燥至恒重的K2SO4 108.75mg，采用1mol/L HCl溶液溶解，于100mL容量瓶中定容，摇匀即可。称取20mg多糖，置于10mL容量瓶中，加入1mol/L HCl溶液2mL于100℃水浴中水解4h，冷却后，补加盐酸至刻度线，用滤纸过滤，除去不溶物质，即得2mg/mL多糖贮存液，4℃保存备用。准确吸取0.2mL多糖贮存液，按标准曲线绘制方法测定吸光度A1、A2，重复三次，计算A1-A2的平均值，由标准曲线计算硫酸基含量，进而转换成硫酸基取代度。
实验结果
高压均质法提取黑木耳多糖的较佳工艺条件为均质压力200MPa，料液比1:80g/mL，均质10次，在此工艺条件下多糖得率可达到46.85%。与常压水提多糖相比，高压均质法提取得到的多糖粘均分子量小，抗氧化活性较强。经乙醇分级得到不同的黑木耳片段HAAP20%、HAAP40%、HAAP60%、HAAP80%，体外抗氧化试验表明HAAP80%的抗氧化活性较佳。
浓硫酸法修饰HAAP80%的较佳工艺条件为反应时间0.9h，浓硫酸体积8.0mL，硫酸铵用量130mg，在此工艺条件下硫酸化多糖SHAAP的硫酸基取代度可达到0.595。红外光谱分析显示，SHAAP保留了多糖母体的特征吸收峰，且存在于指纹区的硫酸基特征吸收峰明显增强，表明硫酸化修饰成功；紫外光谱分析显示，SHAAP不含核酸和蛋白质；刚果红实验结果显示，SHAAP具有稳定的三股螺旋构象；GPC图谱表明，SHAAP分子大小均一；单糖分析表明，SHAAP由葡萄糖、甘露糖组成，摩尔比为1:1.69；高碘酸氧化结果表明，SHAAP中存在1→或1→6或1→2或 1→2,6糖苷键；Smith降解结果显示，SHAAP中存在不被高碘酸钠氧化的1→3糖苷键。
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响应面法优化黑木耳多糖的制备工艺研究_.pdf |
