重组人睫状神经营养因子脂质体制备及表征
2019-03-27 16:25:52
睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)较初是从鸡胚的眼组织睫状节中提取出来,因对睫状节神经元有营养作用并可维持鸡副交感神经节的存活而得名.经研究发现,CNTF具有多种功能,在神经系统,肌肉系统,肥胖症及其相关疾病的治疗中有重要意义,具有广阔的临床开发前景.天然序列的CNTF蛋白因其不良反应较大,在临床应用上受到影响,为寻找安全有效的CNTF,人们已研究出多种CNTF的突变体.另外,由于血脑屏障的阻隔,CNTF到达中枢神经系统的剂量受限,妨碍了CNTF用于帕金森氏症、老年痴呆症等疾病的治疗.脂质体作为药物的载体,具有生物降解性和生物相容性,可通过吸收介导的胞吞作用更为高效地进入血脑屏障.由于一个100nm的脂质体分子可以包裹上万个药物分子,所以脂质体可以显著地增加药物在脑部的转运量,脂质体复合制剂为CNTF在中枢神经系统中用药提供了可行的途径.
材料和仪器
rhCNTF原液(重庆富进生物医药公司制备);Human CNTF ELISA试剂盒(美国R&D Systems Inc.);单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1,重庆富进生物医药公司);胆固醇、磷脂酰乙醇胺(DSPE,美国Sigma公司).
JYD-650智能型声波细胞粉碎机(上海三信仪器有限公司);85A旋转蒸发仪(上海医械专机厂);NanoGenizer30K微射流高压均质机(美国Genizer);LC-2010高效液相色谱仪(日本岛津);Zetasizer3000激光粒子测定仪(英国马尔文);CP100MX速冷冻离心机(日本日立).
方法与结论
rhCNTF脂质体的制备:精密称取250mg GM1、500mg DSPE和胆固醇1000mg溶解于50mL氯仿-甲醇(7:3)有机溶剂中,充分溶解,减压旋转蒸发成薄膜,真空去除残余有机溶剂,加入溶有rhCNTF的10mmol·L−1 pH7.4磷酸盐缓冲液(phosphate buffer,PB)洗膜,在37℃水浴中水合2h,制得水性混悬液,再经探头声(功率50W,声5s,间隔4s,声25次),均质后过脂质体挤出器(滤膜孔径100,200nm),获得rhCNTF脂质体.
用10mmol·L−1 pH7.4 PB配制1mg·mL−1的rhCNTF储备液1,精密量取储备液适量,用流动相A稀释成质量浓度为10,20,50,100,250,500,750,1000μg·mL−1 rhCNTF溶液,分别进样20μL HPLC测定峰面积,以峰面积Y对质量浓度X作线性回归，确定峰面积与质量浓度间的关系.将rhCNTF脂质体溶于1mL双蒸水,再稀释10倍后,100000r·min−1离心2h,洗涤收集各离心液,将沉淀移至10mL量瓶中,用甲醇破乳,并用流动相A定容至刻度,摇匀,HPLC测定浓度.根据离心沉淀和上清的峰面积,确定rhCNTF浓度及含量,按以下公式计算包封率.
包封率%=1−
×100%
结论:采用有机溶剂为氯仿、甲醇,声功率50W,间隙时间4s,声时间5s声次数25次制得的rhCNTF脂质体重复性好,粒度分布均匀,包封率稳定.峰面积Y对质量浓度X作线性回归,回归方程为:Y=12244X+22423(r=0.9999),表明在10~1000μg内线性关系良好.制备得到的rhCNT脂质体的包封率为93.14±3.21(n=5),rhCNTF脂质体粒径为20~200nm,分布均匀,平均粒径为85nm.
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