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生物素介导的胰腺癌靶向聚合物胶束制备

2018-11-05 09:20:37

肿瘤细胞表面特定的受体为药物“定向于”靶组织提供重要的识别位点,是实现肿瘤靶向递药的重要生物学基础,而通过此类受体的相应配体(导向分子)介导则是靶向递药的重要策略.维生素是细胞生长的必需物质,肿瘤细胞因其快速增殖需要消耗大量的维生素,在其细胞表面往往过度表达多种维生素受体,因此, 一些维生素受体具有成为肿瘤生物标志物的重要潜力.而维生素分子量小、体内稳定性强且易通过化学方法与其他材料相偶联,若作为导向功能分子,与多肽、蛋白等大分子相比有一定的优势.例如,因部分肿瘤表面高度表达叶酸受体,叶酸在介导肿瘤靶向递药、显像与诊断等方面得到了广泛的研究.生物素又称维生素H、辅酶R,是一种维持生长、发育的必要营养素,在细胞分裂(包括肿瘤细胞的分裂)中发挥了重要作用.近年来研究表明,一些过度表达叶酸受体或维生素B12受体等肿瘤细胞同时也高表达生物素受体,而且生物素受体往往具有更高的表达量.针对同一种肿瘤细胞分别采用不同维生素作为导向分子的递药研究显示,生物素表现出比叶酸、核黄素等更优的靶向性.目前,以生物素为导向分子介导靶向治疗研究的“抑瘤谱”已经涵盖了卵巢癌、结肠癌、肺癌、肾癌和乳腺癌等多种肿瘤,体现出良好的应用前景.

光动力治疗(photodynamic therapy,PDT)是继放化疗后又一种新的肿瘤治疗方法,其原理是光敏剂遇到特定波长光激发后产生的单线态氧能直接杀死肿瘤细胞.同时,PDT还能破坏肿瘤内血管,阻止肿瘤细胞从机体摄取其所需营养物质.此外,光敏剂还能激活机体免疫系统,进一步增强对肿瘤的治疗效果.光动力治疗也面临进一步提高疗效和降低毒副作用的客观需求,如多数光敏剂的理化性质不理想(疏水性强和溶解性差),对其药效充分发挥有一定的限制,而过量的光辐照也会产生光毒炎症.结合纳米载体增溶和靶向递释等策略,有望显著提高光敏剂在病灶部位的蓄积程度,实现高效低毒的治疗目标.胰腺癌被称为癌症之王,其恶性程度高,手术切除率低,化疗、放疗均不敏感,发病率和死亡率近年来明显上升.光动力疗法结合药物靶向递送有望为胰腺癌治疗提供有益思路.竹红菌乙素(hypocrellin B,HB)是一种新型天然苝醌类光敏剂,已被广泛用于治疗类风湿关节炎、胃炎、胃、十二指肠溃疡病和真菌感染性皮肤病.与传统的光敏剂相比,竹红菌乙素的单线态氧产率高,对肿瘤细胞和病毒具有明显的光动力作用.基于此,本文拟探索以生物素为导向分子、纳米胶束为载体递送光敏剂实现胰腺癌实体瘤的光动力靶向治疗.
材料与仪器

竹红菌乙素(hypocrellin B,HB,上海源叶生物科技有限公司);聚乙二醇−磷脂酰乙醇胺[poly(ethylene glycol)-distearoyl phosphatidyl ethanolamine,mPEG2000-DSPE],生物素化聚乙二醇−二硬脂酰磷脂酰乙醇胺[biotin-poly(ethylene glycol)-distearoyl phosphatidyl ethanolamine, Biotin-PEG3400-DSPE](Avanti Polar Lipids公司)、1,1(十八烷基)-3,3,3,3'-四甲基吲碘(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindotricarbocyanineiodide,DiR,美国Invitrogen公司);尼罗红(Nile Red,Nil,上海晶纯生化科技股份有限公司);2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(2',7'-dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA,天津希恩思生化科技有限公司);胎牛血清(美国Gibco 公司),其他试剂均为分析纯.

激光粒度分析仪(Nano ZS,英国马尔文公司);脂质体挤出器(Gextruder,美国Genizer公司);流式细胞仪(ACEA NovoCyte,杭州艾森生物有限公司);荧光倒置显微镜(IX-73,日本奥林巴斯);小动物活体成像系统(FX PRO,美国Bruker公司).
方法与结果

胶束的制备将HB溶于氯仿中,质量浓度为0.5mg·mL−1.称取适量的mPEG2000-DSPE和Biotin-PEG3400-DSPE混合溶解于氯仿中,加入适量的上述竹红菌乙素溶液,减压除去有机溶剂并旋转成膜,以pH7.4的PBS缓冲液于37℃水化,经脂质体挤出器过30nm膜,即得载竹红菌乙素的生物素修饰胶束(BHB/MIC).非修饰的载竹红菌乙素胶束(HB/MIC)制备方法相同,只是制备时不加Biotin-PEG3400-DSPE.按同样方法制备包载不同荧光探针的胶束用于后续表征实验(以Nil为荧光探针,分别制备Nil/MIC和B-Nil/MIC;以DiR为荧光探针,分别制备DiR/MIC、B-DiR/MIC).胶束的表征对所得胶束进行粒径和多分散度(polydispersity index,PDI)测定.采用紫外分光光度法测定药物包封率.确定竹红菌乙素的最大吸收波长(λmax)为259nm,绘制竹红菌乙素在该条件下的标准曲线.测定竹红菌乙素胶束包封率:取载药后未经纯化的竹红菌乙素胶束两份,一份经葡聚糖凝胶柱纯化后收集,另一份不作其他处理仅稀释至同样体积,均加入3倍体积甲醇破乳24h,采用UV(λmax=259nm)法测定总的竹红菌乙素浓度C0及胶束中竹红菌乙素的浓度C.按以下公式计算包封率 (EE):EE=C/C0×100%.同法测定荧光素的包封率.

结果表明,5%(mol/mol)比例的生物素修饰具有相对较好的体内外靶向性,其载药制剂粒径较小[(36.74±2.16)nm]且分布较均一,药物的包封率较高,达到(80.06±0.19)%.药效评价显示,经生物素介导能提高光敏剂对BxPC-3细胞的光毒性,在体内则表现为显著抑制裸鼠皮下瘤生长.

生物素介导的胰腺癌靶向聚合物胶束制备及其用于光动力治疗的初步研究.pdf
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