丹酚酸B-TAT脂质体的制备与研究
2019-10-12 12:53:03
丹酚酸B是活血化瘀中药丹参中含量可高达的水溶性成分,或是抗纤维化疾病的主要药效成分.研究表明,SAB抗纤维化的作用机制可能与其抗自由基过氧化损伤,抑制成纤维细胞增殖,作用于TGF/Smads等多个信号转导通路,下调细胞III型胶原蛋白COL-III等细胞因子的表达有关.增生性瘢痕是一种临床常见但治愈率较低的皮肤纤维化疾病.现在认为HS可能和皮肤炎症过度反应有关,表皮再生延迟、新生血管形成增强,导致典型细胞外基质合成、沉淀和重塑.许多细胞参与了HS的形成,以皮肤成纤维细胞为关键效应细胞.脂质体的结构类似生物膜,又被称为"人工生物膜",是一种新型的给药载体.细胞穿膜肽TAT是一种具有高度细胞穿透能力的小分子多肽,聚乙二醇和TAT共同修饰的脂质体透皮给药体系,能高效地透过皮肤角质层屏障,增强真皮层的药物递送和细胞摄取,从而更好地发挥药效.
材料与仪器
丹酚酸B原料药(南京泽朗生物科技有限公司,质量分数>99%);大豆卵磷脂(S100,德国 Lipoid公司);DSPE-PEG1000,DSPE-PEG2000(美国NANOCS公司);DSPE-PEG1000-TAT(TAT,Cys-AYGRKKRRQRRR,美国NANOCS公司);胆固醇(Chol,上海艾韦特医药科技有限公司);载丹酚酸B的穿膜肽TAT修饰脂质体(SAB-TAT-LIP,实验室自制);24孔PLOY小室(美国Costar公司);四甲基偶氮唑盐细胞活性检测试剂盒(MTT,美国Sigma公司);高糖DMEM(美国Gibco公司);胰酶TrypLE Express Enzyme(美国Gibco公司);PBS(美国HyClone公司);0.5%结晶紫染液(matrigel,美国BD公司);牛血清白蛋白(BSA,澳大利亚).
BP211D型1/10万电子天平(德国Sartorius公司);JY-96IIN型声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司);Gextuder-100ml型脂质体挤出器(美国Genizer公司);PHS-25型电子数显pH计(上海雷磁仪电科学仪器有限公司);MCO-18AIC CO2恒温培养箱(日本三洋电机株式会社);流式细胞仪(美国BD公司);HNY-211C欧诺恒温摇床(天津市欧诺仪器仪表有限公司).
方法与结果
SAB-TAT-LIP的制备:采用pH梯度-逆向蒸发法制备:精密称取处方量的S100,Chol,DSPE-PEG1000,DSPE-PEG2000,DSPE-PEG1000-TAT(100:33.33:2:1:1)溶于有机溶剂(氯仿-甲醇2:1),SAB溶于1%甘氨酸-盐酸缓冲盐溶液(pH3.20),将两相体系转移入250mL茄形瓶中,置于旋转蒸发仪中旋干有机溶剂,在氮气氛围下放置过夜吹干残留的有机溶剂,加入适量的PBS缓冲盐溶液调至pH6.0,继续孵育30min形成脂质体乳液,探头声180次(功率300W,1s间隔1s),过0.8μm的微孔滤膜,然后用400nm脂质体挤出仪来回挤出15次整粒,即得SAB-TAT-LIP.同法制备不含SAB的空白脂质体(Blank-LIP),SAB常规脂质体(SAB-LIP).
采用滤法测定SAB-TAT-LIP的包封率.同时将SAB-TAT-LIP稀释至适宜浓度,滴至铜筛网上,用4%磷钨酸负染,自然干燥后,置于电镜下观察形态并拍照.将SAB-TAT-LIP稀释至适宜浓度,置于激光散射粒度分布分析仪中,测定其平均粒径、PDI和Zeta电位.采用改良Franz扩散池,以大鼠皮肤为透皮屏障,考察脂质体的体外透皮性质.经检测得平均粒径为(183.2±4.09)nm，PDI为0.190,Zeta电位为(-9.25±0.92)mV,包封率为(86.70±0.85)%,载药量为(6.3±0.34)g·L-1.SAB-TAT-LIP给药浓度的增加,死亡数量增多,细胞SAB-TAT-LIP置于4℃冰箱保存10 d,包封率大于80%,粒径大小没有明显变化,稳定性良好.SAB-TAT-LIP体外32h经皮渗透动力学符合零级方程模型,Q=28.33X+22.61(R2=0.9957),皮肤累积透过率为17.21%,稳态透皮速率J为(28.33±4.9)μg·cm-2·h-1,表观透皮系数Papp为3.19cm2·s-1,真皮层滞留量为(44.39±6.87)μg·cm-2,显著高于SAB溶液和SAB-LIP,透皮行为满足局部透皮给药制剂的透皮规律.
SAB-TAT-LIP脂质体分别干预24,48,72H后HSF存活率
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丹酚酸B-TAT脂质体对HSF细胞增殖、侵袭和细胞周期的影响.pdf |
