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酪氨酸激酶抑制剂脂质体的制备及表征

2018-12-29 23:31:44

Src-家族酪氨酸激酶(Src-Family Tyrosine Kinases,SFK)是一组非受体性的蛋白酪氨酸激酶,我们的前期研究表明,在体外实验性白内障的发生中存在SFK 的异常激活,PP1(4-Amino-5-(4-methylphenyl)-7-(t-butyl)pyrazolo[3,4-d]-pyrimidine)作为SFK的特异性抑制剂,在10μM浓度下,能有效阻止白内障的发生.研究中我们发现,使用PP1点眼后,眼内房水中PP1的浓度很低,因此,我们期望通过改变PP1的剂型,达到提高PP1在靶组织-晶状体浓度的目的.脂质体是由磷脂双分子层包裹形成的封闭囊泡,可以包裹亲水性药物及亲脂性药物.脂质体能延长药物在眼部滞留时间,延长药物半衰期,降低药物毒性.脂质体的均质通常可以使用高压均质机法和脂质体挤出器法.有研究表明,与游离药物相比,经脂质体包备的药物在点眼后房水内会有更高的药物浓度,加之脂质体本身安全性高,目前尚未见脂质体的毒性报道.
材料与仪器

二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC,sigma公司),胆固醇(sigma公司),PP1(sigma公司).磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.2-7.4),三氯甲烷,甲醇,乙腈,二甲基亚砜(DMSO),其中甲醇和乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯.EYELAN-1100旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司),KQ-5200水浴超声波清洗机(河南省巩义市予华仪器有限责任公司),Gextuder-10ml脂质体挤出器(美国Genizer公司),Nano C粒度分析仪(美国Beckman Coulter 公司),ptimal-100xp超速离心机(美国Beckman Coulter 公司),1290 Infinity超高效液相色谱仪(美国Agilent Technologies 公司),TECNAI G2透射电子显微镜(美国FEI公司).
方法与结果

用薄膜水化法联合脂质体挤出器法制备PP1脂质体.取4mg DPPC及处方量胆固醇、PP1溶于装有1mL三氯甲烷的茄形瓶中,加入0.2mL甲醇轻摇混匀,置于旋转蒸发机上减压蒸发去除三氯甲烷.成膜后,继续减压蒸发15分钟,取下茄形瓶,半封口真空过夜,以保证有机溶剂彻底去除.在茄形瓶中加入0.1%吐温80(W/V PBS,pH7.4)3mL,浸泡15分钟后,置于超声波清洗机中,超声水化数分钟后,洗下脂质薄膜,得到PP1脂质体初悬液.用5mL无菌注射器吸取PP1脂质体初悬液,过450nm薄膜后,经脂质体挤出器过50nm滤膜.均匀用力,缓慢挤压过膜15次后即得到PP1脂质体.包封率测定的色谱条件LiChrospher反相C18色谱柱(150×4.6mm,5μm).流动相:乙腈/水(70:30,V/V),流速:0.2mL/min.柱温25℃,进样量20μL.

用薄膜水法制备的PP1脂质体的最优处方的组成为:药脂比为1:10,胆固醇与二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)比为1:8,温度为40℃,水化时间为3min.平均包封率为(63.27±3.32)%.PP1脂质体的平均粒径为(157.73±9.74)nm,Zeta电位为(-4.74±0.44)mV.结论:用薄膜水化法制备出的PP1脂质体包封率高,形态和粒径均匀,重现性好,为研究其在眼部的缓释作用奠定了基础.

过脂质体挤出器后的粒径分布

脂质体挤出器后的粒径分布
正交试验法优选PP1脂质体的制备工艺.pdf



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