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制备阳离子脂质体的高压均质机法和脂质体挤出器法

2018-12-26 16:14:20

阳离子脂质体通常由阳离子脂质(也称细胞转染素)和中性辅助磷脂组成,两成分结合可形成稳定的双层膜结构,同时降低阳离子成分的毒性.常用的中性(或兼性)辅助脂有二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、磷脂酰胆碱(PC)等.DOPE为中性磷脂,具有很强的细胞膜去稳定化作用,并能直接诱导脂质体膜与内体膜融合,从而迅速释放DNA.常用的阳离子脂质3β-[N-(N′,N′-二甲氨基乙基)]-胆固醇(DC-Chol)为一种可生物降解材料,毒性明显低于含酯键的阳离子脂质,在细胞外性质稳定,而进入细胞后易被胞内酯酶降解,从而释放其所包裹的目的基因,故能获得较理想的转染效率,已在临床试验中被证明为非常有效的基因转运载体材料.除阳离子脂质和中性辅助磷脂这两种成分外,还可通过添加其它辅助材料如糖酯生物表面活性剂改善脂质体的性质.糖酯生物表面活性剂具有低毒、高生物降解性和表面活性等优点,对脂质体起稳定作用,为药物微粒载体和人造细胞的首选材料,倍受研究者关注.Igarashi等使用一种糖酯生物表面活性剂甘露糖赤藓糖醇脂-A(MEL-A)以及DCChol和DOPE(摩尔比为2:3:2)制备了MEL-脂质体.在一项对宫颈癌Hela细胞进行的体外转染试验中,通过荧光素酶检测法测得:使用MEL-A脂质体转染的Hela细胞荧光素酶活性大于每毫克蛋白1.4×106cps(countspersecond,每秒计数),而使用Tfx20转染剂和普通阳离子脂质体转染的Hela细胞荧光素酶活性均小于每毫克蛋白1.0×106cps,说明使用MEL-A脂质体转染的细胞其基因表达量高于使用Tfx20转染剂和不含MEL-A的普通阳离子脂质体.且通过共聚焦显微镜可观察到,使用MEL-A脂质体转染的细胞对DNA的摄取量显著高于其它转染剂和普通阳离子脂质体,转染的DNA在细胞质和细胞核附近都有广泛分布,说明MEL-A能增强脂质体与靶细胞的相互作用,提高基因转染效率,是一种极具应用潜力的非病毒载体材料.

一种新型的组氨酸-半乳糖化胆固醇衍生物Gal-His-C4-Cho

一种新型的组氨酸-半乳糖化胆固醇衍生物Gal-His-C4-Cho
 

脂质体大小不均一是影响其体内行为的重要因素,可决定其在生物体内所作用的部位.例如静脉注射给药时,粒径较小的脂质体能够通过肝窦状隙快速到达肝细胞;粒径较大的脂质体则被肺组织摄取,从而经循环系统被清除.因此,脂质体微粒大小不均一,往往导致其体内转染效率比预期低.高压均质机技术(high-pressurehomogenizationextraction,HPHE)是一种降低脂质体粒径的有效方法,广泛应用于工业化大生产.Pupo等以脱水-水合法制备DNA多室脂质体,再采用高压均质技术得到粒径在27~76nm之间的小单室脂质体,其对质粒pBKTSFVtab9和pME2的包封率在72.9%~98.2%之间,载药量为0.309~2.5mg,且即使有十二烷基硫酸钠存在,脂质体也能很好地保护质粒不被核酸酶降解.该法简单、重现性好、制备条件温和,通过调节均质循环次数,可得到不同粒径的阳离子脂质体.此外,该技术还可用于蛋白质等生物大分子脂质体的制备.

脂质体挤出器法是在薄膜分散法的基础上引入膜挤出技术而发展起来的一种新型脂质体制备方法,可制备粒径较小的单层脂质体,且克服了单独使用薄膜法制得的脂质体粒径分布不均匀的缺点.以不同膜材料和膜结构的微滤膜挤压过滤能控制脂质体大小和粒径分布.研究发现,小脂质体易被肿瘤细胞摄取,而大脂质体易被肠摄取,因此不同大小的脂质体可靶向至不同的组织和器官.inrichs等Sanders等采用脂质体挤出器法制备了阳离子脂质体:将类脂DOTAP、DOPE和DSPE-PEG分别按摩尔比48.1:48.1:3.8、45.5:45.5:9或50:50:0溶于氯仿,旋转蒸发除去有机溶剂,室温条件下用氮气流冲洗30分钟,水合,将水合得到的脂质体混悬液通过孔径为100nm的聚酯碳酸膜滤器,反复挤出11次,得到粒径为121~155nm的脂质体,其多分散系数仅为0.06,有效地改善了粒径分布.钟志容等也用薄膜-挤出法制备了平均粒径为(228±8.0)nm的阳离子脂质体,其多分散系数为0.122±0.020,粒径分布均一,能避免阳离子脂质体在体内的分布不均,从而使其体内行为更均一,提高基因转染效率.

用作基因载体的阳离子脂质体及其相关材料与制备技术.pdf



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