阴阳离子脂质体复合物介导的基因转染
2018-12-22 10:16:29
作为非病毒基因载体之一,阳离子脂质体由于其较高的基因携载能力和细胞摄取率而受到青睐.但由于阳离子脂质体表面带有大量正电荷,血循环中容易与体环境中的聚阴离子发生反应,从而引起较大的细胞毒性.脂质体可以通过高压均质机或脂质体挤出器等方法来制备.本实验尝试利用包封质粒(plasmid,pDNA)的阳离子脂质体与阴离子脂质体形成复合物,转染HepG2细胞,考察细胞毒性,从而为双脂质体复合物用于基因治疗奠定实验基础.
材料与仪器
3β-[N-(N',N'-二甲氨基乙基)]氨甲酰基-胆固醇(DC-Chol)(美国Avanti Polar Lipids公司),二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(德国Lipoid公司),胆甾醇半琥珀酸酯(CHEMS)(美国Sigma公司),无血清培养基MEM(美国Hyclone公司),磷酸盐缓冲液(PBS)(美国Hyclone公司),胎牛血清(美国GIBCO公司),4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)粉末(美国Sigma公司),pGPH1/GFP/Neo质粒(上海吉玛制药),HepG2细胞(中科院上海生命科学研究院细胞资源中心).
R系列旋转蒸发器(上海申生科技有限公司),Gextruder脂质体挤出器(美国Genizer公司),ZetaSizer Nano ZS激光粒度分析仪(英国Malvern公司),XW-80型涡旋混合器(上海医学仪器厂),FA1004万分之一天平(上海天平仪器厂),凝胶成像仪(上海复日科技有限公司).
方法与结果
阳离子脂质体制备精密称取适量脂质体膜材料(3β-[N-(N',N'-二甲氨基乙基)]氨甲酰基-胆固醇、二油酰磷脂酰乙醇胺),按摩尔比1:1混合后溶于适量氯仿中,将该溶液加入到梨形烧瓶,充氮气3次,减压旋蒸12h除去氯仿,得到干燥脂质薄膜.加入一定体积的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(20mM,pH7.4),缓缓震摇,将脂质薄膜从瓶壁洗下,得到脂质体混悬液,使充分水合后,通过脂质体挤出器分别通过400、200、100nm聚碳酸酯膜,各10遍,即得阳离子脂质体.
阴离子脂质体制备精密称取适量脂质体膜材料(胆甾醇半琥珀酸酯、二油酰磷脂酰乙醇胺),按摩尔比4:6混合后溶于适量氯仿中,将该溶液加入到梨形烧瓶,充氮气3次,减压旋蒸除去氯仿,真空维持12h,得到干燥的脂质薄膜,加入以一定体积的20mMHEPES缓冲液(pH7.4),缓缓震摇,将脂质薄膜从瓶壁洗下,得到脂质体混悬液,使充分水合后,通过脂质体挤出器分别通过400、200、100nm聚碳酸酯膜，各10遍,即得阴离子脂质体.
zeta电位可以用来衡量微粒体系表面带电情况,阴离子脂质体-阳离子脂质体复合物的zeta电位明显低于阳离子脂质体的zeta电位,说明阴离子脂质体的加入能有效降低复合物的表面电位.刚加入阴离子脂质体时,其复合物zeta电位下降趋势明显;随着阴离子脂质体加入量不断越多,其复合物zeta电位下降趋势平缓.原子力扫描中可看出复合物呈圆球形,粒径在200～300nm.
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