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阳离子脂质体的转染机制及转染效率影响因素

2018-12-06 15:22:48

人类基因组草图的绘制完成及生物化学与分子生物学理论的不断发展为基因治疗打下了坚实基础,基因治疗已成为医学界最活跃的研究领域之一.从最初只是单纯的纠正基因缺陷,到目前能输送表达治疗效应蛋白质的基因,直接或间接杀伤靶器官中的肿瘤细胞,基因治疗的技术在不断地发展,其定义也在不断地完善.实质上基因治疗就是一种以预防和治疗疾病为目的的人类基因转移技术,是以改变人的遗传物质为基础的生物医学治疗.作为一种新的、具有革命性的治疗手段,基因治疗的有效性已得到临床验证.

脂质体在所有已用于临床试验的基因载体中仅次于病毒载体居第二位,是最有发展前景的非病毒载体.在多种类型的脂质体(如阴离子脂质体、免疫脂质体、pH 敏感脂质体、空间稳定化脂质体等)中,由于阳离子脂质体对阴离子型聚电解质阴离子敏感,对带负电荷的DNA有较高的转运能力,还能转运RNA、核糖体及其他大电荷的分子和大分子物质进入细胞,其转染效率比其它脂质体高出许多倍,因而被广泛应用于基因转移技术中.阳离子脂质体分子主要由三部分构成:阳离子头部,连接键和疏水烃尾.带正电的阳离子脂质体分子头部与带负电的DNA的磷酸根之间存在静电引力,是阳离子脂质体DNA复合物形成的主要作用力.连接键是脂质体分子的重要组成部分,直接影响脂质体分子的化学稳定性及生物降解性,是转染效率高低以及细胞毒性大小的重要影响因素.疏水尾部大致有两种:一种是两条脂肪链,另一种是胆固醇,它们对形成稳定的双分子层十分重要.

阳离子脂质体介导基因转移的主要过程如下:首先,阳离子脂质体与带负电的DNA分子通过静电作用形成阳离子脂质体DNA复合物,由于阳离子脂质体过剩,复合物带正电;然后,带正电的阳离子脂质体DNA复合物由于静电作用吸于带负电的细胞膜表面,然后通过与细胞膜融合或胞吞作用进入细胞;最后,阳离子脂质体DNA复合物在细胞内发生分离,阳离子脂质体连接键断裂形成小分子再通过新陈代谢排出细胞,而基因进一步被传递到细胞核内,并在细胞核内转录和翻译,最终产生目的基因编码的蛋白质.下面对这个过程进行具体阐述.

传统的脂质体制备方法有薄膜法、反相蒸发法、钙融合法、去污剂法及脂质体挤出器法等,它们都是先用有机溶剂或表面活性剂溶解磷脂,得到粗制的磷脂双层膜,然后对膜进行水化处理,再通过适当方法得到不同大小的脂质体.但由于工艺本身的缺陷、有机溶剂或表面活性剂的残留都会导致DNA的生物活性降低,而且很难实现大批量脂质体的制备.新的方法有加热法、超声波法、CO2 超临界法等,对于不同的脂质体,不同的制备方法可以得到不同的包封率,进而影响DNA的转染率.所以,应根据具体情况选择合适的制备方法或者在现有的方法基础上进行改进.

Templeton认为用0.1μm脂质体挤出器挤压脂质体,可造成内陷结构,使之具有大的表面积.温和的超声波处理比高频的超声波处理效果好.Smith认为DNA可引起脂质体融合,故DNA加入脂质体以及将形成的复合物注入组织的时间间隔会影响效果.理想的基因载体应该在有效性和安全性上都能满足基因治疗的要求.阳离子脂质体用于基因治疗时,相对于其它的非病毒载体,在转染效率上有明显的优势;而与病毒载体比较时,其安全性又是一大优点.为了提高阳离子脂质体的转染效率,可以在合成和应用两个阶段入手.在合成方面,目前人们的研究大多集中在了针对不同的靶细胞寻找高选择性的靶向性配体方面;也有人另辟蹊径,在脂质体结构中引入含有多个氨基或者亚氨基的基团(如含有咪唑基的组氨酸),利用其质子海绵效应使阳离子脂质体DNA复合物更容易从核内体中脱离出来,在提高转染效率方面颇有成效.在应用方面,将阳离子脂质体和病毒载体混合使用,使非病毒载体的安全性和病毒载体的高效性相结合,也取得了一定进展.随着生物化学和分子生物学的不断发展,阳离子脂质体转染基因机制的研究将不断深入,我们可以根据不同的治疗要求在已有的阳离子脂质体中进行选择或者设计合成新的阳离子脂质体,以达到最好的治疗效果.

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