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Nanogenizer高压均质机破碎大肠杆菌实验

2018-09-18 14:16:22

实验单位:浙江新*生物医药有限公司 2018年8月

、实验方法
      使用降温型均质腔,用低温水浴控温到-4℃。将大肠肝菌在NanoGenizer超高压均质机在控温下下均质3-5次。
 
、破碎率测验方法

2.1 活菌计数法

1、将培养24h的大肠杆菌发酵液4000rpm离心15min,去上清,用缓冲液重新悬浮。

2、取100uL适当稀释,涂布含有氨苄青霉素和氯霉素的平板,进行活菌计数。

3、将剩余的菌液分为2份,用交互容腔型通道,15000psi分别均质3次、5次。

4、均质后的菌液各取100uL,适当稀释,涂布含有氨苄青霉素和氯霉素的平板,进行活菌计数。
2.2 蛋白提取法

先把细菌15000psi分别均质3次、5次。11000-13000rpm离心15min,取上清进行蛋白提取并测定蛋白含量。
 
实验结果


1、均质后外观对比
        

 


均质3次后,菌液中有较多絮状物,且出现分层现象,怀疑是均质不够彻底,菌体碎片比较大;均质5次后溶液较为均一。

 2、均质前计数结果

菌液稀释105倍后,长出大约500个单菌落,可估算出菌液中大肠杆菌的浓度约为5×108个/mL。


  


 3、均质3次计数结果

菌液稀释103倍后,长出大约20个单菌落,可估算出菌液中大肠杆菌的浓度约为2×104个/mL。


    


 4、均质5次后,未检测到活菌。

均质5次后的菌液稀释10倍、102倍、103倍后,均没有长出菌落。
   


5、均质3次和5次的蛋白提取检测结果
 


 

这张图是检测的蛋白,分别是Z型均质3次、Z型均质5次、Y性均质5次。从图上来看,不管是3次还是5次,菌中的蛋白都能提取出来,效果差不多。对于我们的项目而言,均质5次效果更好,可能是细菌被打的很碎的话更容易提取蛋白。
 
结论


1) 均质3次的破碎率(活菌计数法)优于99.99%

2) 均质5次的破碎率(活菌计数法)为100%

3) 均质3次和5次的蛋白提取量一致。


 


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